לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence
Summary
כאן, אנו מתארים גישה כמותית לקביעת ההתפלגות של חלבון סינפטית יחסית חלבון סמן באמצעות צביעת immunofluorescence ‘, ‘ מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח מבוססת מחשב.
Abstract
נוכחות, היעדרות, או רמות של חלבונים סינפטיים מסוימים יכול להשפיע באופן חמור הסינאפסית. בנוסף שחקרתי את הפונקציה של חלבון, זה חיוני גם לקבוע תפוצתו. כאן, אנו מתארים נוהל העסקת immunofluorescence קונפוקלית, מבוססת מחשב ניתוח כדי לקבוע את ההתפלגות של החלבון סינפטית Mover (המכונה גם TPRGL או SVAP30). אנו משווים את חלוקת Mover לזה של synaptophysin חלבון שלפוחית סינפטית, ובכך לקבוע את חלוקת Mover בצורה כמותית יחסית השפע הסינפטיות. ראוי לציין, ניתן ליישום שיטה זו פוטנציאל כדי לאפשר השוואה של ההתפלגות של חלבונים באמצעות נוגדנים שונים או מיקרוסקופ או דרך מחקרים שונים. השיטה שלנו עוקף ההשתנות הטבועה של immunofluorescent stainings נכנע יחס מאשר רמות קרינה פלואורסצנטית מוחלטת. בנוסף, השיטה נתאר מאפשר לנתח את ההתפלגות של חלבון ברמות שונות: מן כל המוח פרוסות לאזורים במוח כדי לאזורי משנה שונים באזור מוח אחד, כגון שכבות שונות של ההיפוקמפוס או חושית cortices. Mover הוא חלבון ספציפי חוליות המשויך הסינפטיות. בשיטה זו, אנו מראים כי Mover heterogeneously מפוזרים על-פני אזורים במוח, עם רמות גבוהות של pallidum הגחון, גרעינים במחיצה הבין-פרוזדורית ו האמיגדלה, וגם בתוך אזורים במוח יחיד, כגון שכבות שונות של ההיפוקמפוס.
Introduction
התקשורת בין הנוירונים קורה באתרי קשר מיוחד שנקרא הסינפסות. הסינפסות להכיל מספר עצום של חלבונים שונים שננהל הסינאפסית. חלק אלה חלבונים להראות התפלגות הטרוגנית לאורך מערכת העצבים, אינם נוכחים בכל סינפסה1. דוגמה אחת על חלבון כזה היא Munc13, שבה הוא מעורב בתהליך לקרקע של הסינפטיות. ישנם איזופורמים שונים של Munc13, אשר heterogeneously מופצים ברחבי המוח2, נוכחות או היעדרות של איזופורמים ספציפי יכול להשפיע לטווח קצר פלסטיות סינפטית, שלפוחית סינפטית dynamics3, 4 , 5. לפיכך, יש חשיבות חיונית כדי להיות מסוגל לזהות הנוכחות של חלבונים סינפטיים שונים על פני אזורים במוח.
השיטות של בחירה על כימות של חלבונים סינפטיים – כה – הן ספקטרומטר מסה המערבי סופג, במקום אימונוהיסטוכימיה6,7,8,9. במקרים מסוימים, מספר שיטות משמשות משלימים אחד את השני כדי להעריך את הכמות וגם הלוקליזציה של חלבונים ספציפיים (קרי, וילהלם. et al. 10). שיטת נתאר כאן מאפשרת התאמה לשפות אחרות, כימות של חלבונים עניין ללא צורך באמצעות כל שיטה ביוכימית, פשוט העסקת immunofluorescent stainings. יתרון נוסף כאן הוא כימות יכול להיעשות על אזורים הרבה יותר קטן, לכן, ספציפיות יותר, מאשר אלה מושגת על ידי שיטות אחרות. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי חלבון התייחסות אמין יש צורך להעריך את ההתפלגות של החלבון עניין.
צביעת פלורסנט מאת אימונוהיסטוכימיה מאפשר לנו לזהות באופן שגרתי הלוקליזציה של חלבונים על פני אזורים במוח, כמו גם בתוך תאים עצביים שונים. כדי לזהות את מדורים שונים, משמשות סמני ספציפיים. בדרך כלל, נוגדנים נגד סינפסין ו synaptophysin11 ניתן לתייג הסינפטיות, בעוד נוגדנים נגד בסון תווית האזור הפעיל של מסוף presynaptic12. Vesicular מובילים, כגון שנאים גלוטמט vesicular (vGluT) או גאבא vesicular טרנספורטר (vGAT), משמשים להוספת תווית סינאפסות13 ו מעכבות14 מסופי presynaptic, בהתאמה. בצד postsynaptic, נוגדנים נגד החלבון הומר יכול להיות מועסק כדי לסמן מסופי postsynaptic ולאחר נוגדנים נגד צפיפות postsynaptic חלבון 95 (PSD95)15,16,17 או gephyrin18 , 19 , 20 יכול תווית מסופי postsynaptic סינאפסות או מעכבות, בהתאמה. באמצעות נוגדנים נגד חלבון של עניין סמנים כגון אלה שתוארו לעיל, ניתן לקבוע הלוקליזציה של חלבון כזה. מחקרים רבים עד היום לעשות את זה באופן איכותי21 עם זאת, כדי לקבוע באופן אמין ההתפלגות דיפרנציאלית של חלבון ספציפי סינפטית, אחד חייב לא רק לקבוע נוכחותו או היעדרות אלא גם הריכוז היחסי שלו. את הטרוגניות בגדלים וצפיפות של הסינפסות הופך חשוב להקים יחס בין דה מרקר סינפטית החלבון עניין. אחרת, סינפסה-עשיר אזורים כגון שכבות שאינן פירמידה של ההיפוקמפוס, השכבה המולקולרית של הצרבלום יראה צפיפות גבוהה של חלבונים סינפטיים, רק בשל צפיפות גבוהה יותר של הסינפסות אך לא בשל נוכחות חזקה של חלבון זה כל סינפסה (למשל, Wallrafen, Dresbach1). מצד שני, חלבונים ב- סומא עצביים (למשל, TGN3822) בדרך כלל יראה נוכחות חזקה שכבת תאים כפירמידה בהיפוקמפוס או שכבת תאים בהיפוקמפוס או אסטרוציטומה גרגר בשל הריכוז הגבוה של גופי תאים עצביים באזורים אלו. לכן, התפלגות זו אי-הומוגניות של מבנים, במקרה זה synapses, יכול להוביל שערוך שווא של ההתפלגות של החלבון עניין עצמו. יתר על כן, יש השתנות מהותי צביעת עוצמות מדגמים ב- immunohistochemical stainings. הפרוטוקול המתואר כאן לוקח זאת בחשבון ומונעת הטיות כזה, כמו גם אזהרות אחרים הנובעים משימוש בשיטות immunohistochemical.
האחרונים שלנו לומדים, אנחנו השתמשו בשיטה זו כדי לתאר את הביטוי דיפרנציאלית של Mover (הנקרא גם TPRGL23 או SVAP3024) על פני אזורים שונים במוח116. Mover הוא חלבון ספציפי חוליות סינפטית זה ניתן למצוא האגודה כדי הסינפטיות ומשפיע על2726,25,שחרור נוירוטרנסמיטר. לנו יש הקשורים לביטוי Mover שפע הסינפטיות, על ידי צביעת עבור synaptophysin כסמן הפניה שלפוחית סינפטית. מצאנו רמות גבוהות של Mover בפרט גרעינים במחיצה הבין-פרוזדורית pallidum על הגחון, האמיגדלה. בתוך ההיפוקמפוס, מצאנו בהתפלגות הטרוגנית של Mover, עם רמות גבוהות הרבדים הקשורים למחשוב אינטרה-בהיפוקמפוס, רמות נמוכות בשכבות הקלט והפלט.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המוצגת כאן מטרות ב לכימות ההתפלגות של חלבון עניין יחסית השפע של חלבון מרקר עם התפלגות ידוע. Immunofluorescence מכתים יכול להראות השתנות גבוהה של צביעת עוצמות בין הפרוסות שונים. הגישה כימות המתוארים כאן עוקף את הבעיה על-ידי קביעת היחס של החלבון לעניין הממוצע על פני הכדור. לכן, עוצמות מכתימים ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים אירמגרד וייס לסיוע טכני מעולה. המחברים להכיר תמיכה על ידי הרמס Pofantis ו Andoniya Petkova. המחברים גם תודה מכון מדעי המוח האירופית השימוש של LSM800, סיוע טכני, במיוחד על ידי ד ר נילס Halbsgut. עבודה זו מומן על ידי גטינגן במרכז הרפואי אוניברסיטת. JSV מאשר תמיכה על ידי המרכז עבור ננו מיקרוסקופ ופיזיולוגיה מולקולרית של המוח (CNMPB).
Materials
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
References
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. . Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
