Quantifier la répartition hétérogène d’une protéine synaptique dans le cerveau de souris à l’aide d’Immunofluorescence
Summary
Nous décrivons ici une approche quantitative pour déterminer la répartition d’une protéine synaptique par rapport à une protéine de marqueur à l’aide d’immunofluorescence souillant, microscopie confocale et analyse assistée par ordinateur.
Abstract
La présence, l’absence ou niveaux de protéines synaptiques spécifiques peuvent influencer considérablement la transmission synaptique. En plus d’élucider la fonction d’une protéine, il faut également déterminer sa diffusion. Nous décrivons ici un protocole utilisant l’immunofluorescence, microscopie confocale et l’analyse assistée par ordinateur pour déterminer la distribution de la protéine synaptique Mover (également appelé TPRGL ou SVAP30). On compare la distribution de Mover à celui de la vésicule synaptique protéine synaptophysine, déterminant ainsi la distribution de Mover de manière quantitative par rapport à l’abondance des vésicules synaptiques. Notamment, cette méthode pourrait potentiellement être mises en œuvre pour permettre une comparaison de la distribution des protéines à l’aide d’anticorps différents ou microscopes ou à travers différentes études. Notre méthode contourne la variabilité inhérente des salissures par immunofluorescence en cédant un rapport plutôt que des niveaux de fluorescence absolue. En outre, la méthode que nous décrivons permet au chercheur d’analyser la distribution d’une protéine à différents niveaux : des tranches de cerveau entier de régions du cerveau dans différentes sous-régions dans la zone d’un cerveau, telles que les différentes couches de l’hippocampe ou sensorielles cortex. Mover est une protéine spécifique vertébré associé de vésicules synaptiques. Avec cette méthode, nous montrons que le déménageur est hétérogène dans les zones du cerveau, avec des concentrations élevées dans le pallidum ventral, les noyaux septums et l’amygdale et aussi dans les zones du cerveau unique, telles que les différentes couches de l’hippocampe.
Introduction
Communication entre les neurones se passe à des sites de contact spécialisées appelées synapses. Synapses contiennent une multitude de différentes protéines qui orchestrent la transmission synaptique. Certaines de ces protéines présentent une distribution hétérogène dans le système nerveux et ne sont pas présents dans chaque synapse1. Un exemple d’une telle protéine est Munc13, qui est impliqué dans le processus d’amorçage de vésicules synaptiques. Il existe différentes isoformes de Munc13, qui sont hétérogène dans tout le cerveau2, et la présence ou l’absence des isoformes spécifiques peut influer sur la plasticité synaptique à court terme et la vésicule synaptique dynamique3, 4 , 5. par conséquent, il est d’une importance vitale pour pouvoir identifier la présence de différentes protéines synaptiques dans certaines zones du cerveau.
Les méthodes de choix pour la quantification des protéines synaptiques – jusqu’à présent – sont la spectrométrie de masse et de Western Blot, plutôt que d’immunohistochimie6,7,8,9. Dans certains cas, plusieurs méthodes sont utilisées pour se compléter mutuellement afin d’évaluer la quantité et la localisation des protéines spécifiques (p. ex., Wilhelm et al. 10). la méthode que nous décrivons ici permet la localisation et quantification des protéines d’intérêt sans avoir besoin d’utiliser toute méthode biochimique, employant simplement les salissures par immunofluorescence. Un autre avantage ici est que la quantification peut être faite sur des zones beaucoup plus petites et, donc, plus précise, que ceux réalisés par d’autres méthodes. Cependant, il faut prendre en considération qu’une protéine de référence fiable est nécessaire pour évaluer la distribution de la protéine d’intérêt.
Une coloration fluorescente par immunohistochimie permet d’identifier systématiquement la localisation des protéines dans certaines zones du cerveau ainsi que dans différents compartiments neuronales. Pour identifier les différents compartiments, marqueurs spécifiques sont utilisés. En général, anticorps contre synapsine et synaptophysine11 peuvent être utilisés pour étiqueter des vésicules synaptiques, tandis que les anticorps contre basson étiqueter la zone active d’un présynaptique borne12. Transporteurs vésiculaires, tels que les transporteurs de glutamate vésiculaire (vGluT) ou le transporteur vésiculaire de GABA (vGAT), sont utilisés pour étiqueter les excitateurs13 et inhibitrice14 terminaisons présynaptiques, respectivement. Côté postsynaptique, anticorps dirigés contre la protéine Homer peuvent être utilisées pour marquer les bornes postsynaptiques et anticorps contre densité postsynaptique protéine 95 (PSD95)15,16,17 ou gephyrin18 , 19 , 20 peut marquer les bornes postsynaptiques excitateurs ou inhibiteurs, respectivement. En utilisant des anticorps contre une protéine d’intérêt et de marqueurs tels que ceux décrits ci-dessus, on peut déterminer la localisation de cette protéine. De nombreuses études à ce jour l’ont fait dans une manière qualitative21. Toutefois, pour déterminer de manière fiable la distribution différentielle d’une protéine synaptique spécifique, il faut non seulement déterminer sa présence ou absence, mais aussi sa concentration relative. L’hétérogénéité de la taille et la densité des synapses rendent important d’établir un rapport entre le marqueur synaptique et la protéine d’intérêt. Dans le cas contraire, les régions riches en synapse tels que les couches non pyramidaux de l’hippocampe et la couche moléculaire du cervelet montrera une densité élevée de protéines synaptiques, uniquement en raison de la densité plus élevée des synapses mais pas en raison d’une forte présence de cette protéine dans chaque synapse (p. ex., Wallrafen et Dresbach1). En revanche, les protéines dans le soma neuronal (par exemple, TGN3822) affichera généralement forte présence dans la couche de cellules pyramidales hippocampe ou la couche de cellules hippocampiques ou cérébelleux granule en raison de la forte concentration de corps des cellules neuronales dans ces domaines. Par conséquent, cette répartition non homogène des structures, synapses dans ce cas, peut conduire à une fausse estimation de la distribution de la protéine d’intérêt elle-même. En outre, il y a une variabilité intrinsèque en intensités de coloration dans les trois échantillons de salissures immunohistochimiques. Le protocole décrit ici tienne compte de cela et évite ces préjugés, mais aussi autres avertissements résultant de méthodes immunohistochimiques.
Dans notre récente étude, nous avons utilisé cette méthode pour décrire l’expression différentielle de Mover (également appelée TPRGL23 SVAP3024) l’ensemble 16 cerveau différents domaines1. Mover est une protéine synaptique vertébré spécifiques qui se trouvent en association à des vésicules synaptiques et influence la neurotransmetteur dégagement25,26,27. Nous avons lié l’expression Mover à l’abondance des vésicules synaptiques, par coloration pour synaptophysine comme un repère de vésicules synaptiques. Nous avons trouvé des niveaux élevés de Mover en particulier dans les noyaux septums, le pallidum ventral et l’amygdale. Dans l’hippocampe, nous trouvons une répartition hétérogène des Mover, avec des niveaux élevés dans les couches associées calcul intra-hippocampique et faibles concentrations dans les couches d’entrée et de sortie.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée ici vise à quantifier la distribution d’une protéine d’intérêt par rapport à l’abondance d’une protéine marqueur avec une aire de répartition connue. Immunofluorescence souillant peut montrer une forte variabilité des intensités entre les différentes tranches de coloration. La méthode de quantification décrite ici contourne ce problème en déterminant la proportion de la protéine d’intérêt à la moyenne dans l’ensemble de l’hémisphère. Par conséquent, différentes …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Irmgard Weiss excellente assistance technique. Les auteurs remercient Hermes Pofantis et du Andoniya Petkova. Les auteurs remercient également l’Institut européen des neurosciences pour l’utilisation de la LSM800 et l’assistance technique, notamment par le Dr Nils Halbsgut. Ce travail a été financé par l’université médicale centre de Göttingen. JSV reconnaît la prise en charge par le centre pour la microscopie nanométrique et physiologie moléculaire de la cerveau (CNMPB).
Materials
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
References
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