Kvantifisere heterogene distribusjon av et Synaptic Protein i musen hjernen ved hjelp av Immunofluorescence
Summary
Her beskriver vi en kvantitativ tilnærming til å fastslå fordelingen av et synaptic protein i forhold til en markør protein bruker immunofluorescence flekker, AC confocal mikroskopi og datamaskin analyse.
Abstract
Tilstedeværelse, fravær eller nivåer av bestemte synaptic proteinene kan alvorlig påvirke synaptic overføring. I tillegg til Klargjørende funksjonen av et protein, er det viktig å også bestemme distribusjon. Her beskriver vi en protokoll ansette immunofluorescence AC confocal mikroskopi og datamaskin analyse til fordelingen av synaptic protein Mover (også kalt TPRGL eller SVAP30). Vi sammenligne distribusjonen av Mover som i synaptic vesicle protein synaptophysin, dermed å finne fordelingen av Mover på en kvantitativ måte i forhold til overflod av synaptic blemmer. Spesielt kan denne metoden potensielt implementeres for å tillate sammenligning av fordelingen av proteiner med forskjellige antistoffer eller mikroskop eller på tvers av ulike studier. Vår metoden omgår iboende variasjon av immunofluorescent stainings av gir forholdet i stedet for absolutte fluorescens nivåer. I tillegg metoden vi beskrive gjør forskeren analysere fordelingen av et protein på ulike nivåer: fra hele hjernen sektorene til hjernen regioner til forskjellige delområder i én hjerne område, for eksempel de forskjellige lagene av hippocampus eller sensorisk halvdelene. Mover er et virveldyr-spesifikke protein som er forbundet med synaptic blemmer. Med denne metoden viser vi at Mover heterogeneously er distribuert over hjernen områder, med høy det ventrale pallidum septal kjerner og amygdala, og også innen enkelt hjernen, som forskjellige lag av hippocampus.
Introduction
Kommunikasjon mellom nerveceller skjer på spesialiserte kontakt områder kalt synapser. Synapser inneholder en rekke ulike proteiner som arrangerer synaptic overføring. Noen av disse proteinene viser en heterogen distribusjon over hele nervesystemet og finnes ikke i hver synapse1. Et eksempel for slik et protein er Munc13, som er involvert i grunning prosessen med synaptic blemmer. Det er ulike isoformene av Munc13, som heterogeneously distribueres gjennom hjernen2, og tilstedeværelse eller fravær av bestemte isoformene kan påvirke kortsiktige synaptiske plastisitet og synaptic vesicle dynamics3, 4 , 5. det er derfor av avgjørende betydning å kunne identifisere tilstedeværelsen av ulike synaptic proteiner over hjernen områder.
Metodene valgfrihet for kvantifisering av synaptic proteiner – så langt – er massespektrometri og Western blotting, snarere enn immunohistochemistry6,7,8,9. I noen tilfeller brukes flere metoder til å utfylle hverandre å vurdere både-antallet og lokalisering av spesifikke proteiner (dvs., Wilhelm et al. 10). metoden som beskrives her gjør at lokalisering og kvantifisering av proteiner rundt uten behov for å bruke noen biokjemiske metode, bare ansette immunofluorescent stainings. En annen fordel her er at kvantifiseringen kan gjøres over områder mye mindre, og derfor mer spesifikk, enn de oppnådd ved andre metoder. Imidlertid må man ta i betraktning at en pålitelig referanse protein er nødvendig å vurdere fordelingen av protein av interesse.
Fluorescerende farging av immunhistokjemi tillater oss å rutinemessig identifisere lokaliseringen av proteiner over hjernen områder og i ulike neuronal avdelinger. For å identifisere de ulike avdelinger, brukes bestemte markører. Vanligvis kan antistoffer mot synapsin og synaptophysin11 brukes til å merke synaptic vabler, mens antistoffer mot fagott etiketten aktive sonen for en presynaptic terminal12. Vesicula transportører, som vesicula glutamat transportører (vGluT) eller vesicula GABA transporter (vGAT), brukes til å merke eksitatoriske13 og hemmende14 presynaptic terminaler, henholdsvis. På postsynaptic side, kan antistoffer mot protein Homer brukes til å merke postsynaptic terminaler og antistoffer mot postsynaptic tetthet protein 95 (PSD95)15,16,17 eller gephyrin18 , 19 , 20 kan merke eksitatoriske eller hemmende postsynaptic terminaler, henholdsvis. Ved hjelp av antistoffer mot et protein av interesse og markører som de som er beskrevet ovenfor, kan en avgjøre lokaliseringen av slike protein. Mange studier hittil har gjort dette i en kvalitativ måte21. Imidlertid å pålitelig bestemme differensial fordelingen av en bestemt synaptic protein, må en ikke bare finne sin tilstedeværelse eller fravær, men også sin relative konsentrasjon. Heterogenitet størrelser og tetthet av synapser gjør det viktig å etablere et forhold mellom synaptic markøren og protein av interesse. Ellers viser synapse-rike regioner som ikke-pyramideformet lag av hippocampus og molekylære laget av lillehjernen en høy tetthet av synaptic proteiner, bare på grunn av høyere tettheten av synapser, men ikke på grunn av en sterk tilstedeværelse av dette proteinet i hver synapse (f.eks, Wallrafen og Dresbach1). På den annen side, viser proteiner i neuronal soma (f.eks, TGN3822) vanligvis sterk tilstedeværelse i hippocampus pyramideformet celle laget eller hippocampus eller lillehjernen granule celle lag på grunn av den høye konsentrasjonen av neuronal cellen legemer i disse områdene. Derfor denne ikke-homogene fordelingen av strukturer, i dette tilfellet synapser, kan føre til en falsk estimering av fordelingen av protein rundt seg. Videre er det en iboende variasjon i flekker intensiteter over prøvene i immunohistochemical stainings. Protokollen beskrevet her tar dette i betraktning, og unngår slike fordommer, samt andre advarsler som oppstår fra immunohistochemical metoder.
I vår siste studie, vi har brukt denne metoden for å beskrive differensial uttrykk for Mover (også kalt TPRGL23 eller SVAP3024) over 16 forskjellige hjernen områder1. Mover er en virveldyr-spesifikke synaptic protein som finnes i tilknytning til synaptic blemmer og påvirker nevrotransmitter utgivelsen25,26,27. Vi har knyttet Mover uttrykket til overflod av synaptic blemmer, av flekker for synaptophysin som en synaptic vesicle referanse markør. Vi fant høye nivåer av Mover spesielt i septal kjerner og det ventrale pallidum amygdala. I hippocampus fant vi en heterogen fordeling av Mover, med høy i lagene knyttet intra-hippocampus beregning og lave nivåer i inn- og utgang lag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som presenteres her tar sikte på å kvantifisere distribusjon av et protein av interesse i forhold til overflod av en markør protein med en kjent distribusjon. Immunofluorescence flekker kan vise en høy variasjon av flekker intensiteter mellom forskjellige stykker. Kvantifisering tilnærming beskrevet her omgår dette problemet ved å bestemme forholdet mellom protein av interesse for gjennomsnittlige over halvkulen. Derfor ulike flekker intensiteter over skiver er kansellert og la en kvantitativ beskrivelse.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Irmgard Weiss for utmerket kundestøtte. Forfatterne bekrefter støtte av Hermes Pofantis og Andoniya Petkova. Forfatterne takker også europeiske nevrovitenskap Institutt for bruken av LSM800 og teknisk assistanse, spesielt av Dr. Nils Halbsgut. Dette arbeidet ble finansiert av University Medical Center Göttingen. JSV erkjenner støtte av Center for nanoskala mikroskopi og molekylære fysiologi av hjernen (CNMPB).
Materials
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
References
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. . Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
