JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Een Tripeptide-gestabiliseerde Nanoemulsion van oliezuur

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59034
, , , ,
1Department of Chemistry,Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women’s Health Research Institute,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research,Western Connecticut Health Network

Summary

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode om een nanoemulsion voor een oliezuurgehalte acids-platinum(II) conjugate gestabiliseerd met een lysine-tyrosine-fenylalanine (KYF)-tripeptide synthetiseren. De nanoemulsion vormen onder zachte synthetische voorwaarden via zelf-assemblage van de KYF en de geconjugeerde.

Abstract

Beschrijven we een methode voor de productie van een nanoemulsion samengesteld uit een oliezuurgehalte acids-Pt(II) kern en een lysine-tyrosine-fenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). De KYF-Pt-NE Pt(II) kapselt op 10 pm %, heeft een diameter van 107 ± 27 nm en een negatieve lading van de oppervlakte. De KYF-Pt-NE is stabiel in water en in serum, en biologisch actief is. De vervoeging van een fluorophore te KYF kunt de synthese van een fluorescerende nanoemulsion die geschikt is voor biologische beeldvorming. De synthese van de nanoemulsion wordt uitgevoerd in een waterige omgeving, en de vormen van de KYF-Pt-NE via zelf-assemblage van een korte KYF peptide en een conjugaat oliezuurgehalte acids-platinum(II). De zelf-assemblage proces hangt af van de temperatuur van de oplossing, de molaire verhouding van de substraten, en het debiet van de toevoeging van het substraat. Cruciale stappen omvatten handhaven van de optimale roeren tarief tijdens de synthese toelaat voldoende tijd voor zelf-assemblage en de nanoemulsion vooraf geleidelijk te concentreren in een centrifugaal concentrator.

Introduction

In de afgelopen jaren is er een groeiende interesse in de engineering van nanodeeltjes voor biomedische toepassingen zoals drug delivery en bioimaging1,,2,,3,4. De multifunctionaliteit van de nanoparticle gebaseerde systemen vereist vaak meerdere componenten binnen een formulering opnemen. De bouwstenen die zijn gebaseerd op lipiden of polymeren vaak verschillen in hun fysisch-chemische eigenschappen alsmede hun biocompatibiliteit en biologische afbreekbaarheid, die uiteindelijk gevolgen voor de functie van de nanostructuur1, hebben kan 5,6. Biologisch afgeleide materialen, zoals eiwitten en peptiden, hebben lang erkend als veelbelovende onderdelen van multifunctionele nanostructuren vanwege hun volgorde flexibiliteit7,8. Peptiden zelf monteren in zeer geordende supramoleculaire platforms vormen spiraalvormige ribbons9,10, vezelig steigers11,12, en nog veel meer, dus de weg effent naar gebouw Biomolecuul gebaseerde hybride nanostructuren met behulp van een bottom-up aanpak13.

Peptiden werden onderzocht voor toepassingen in geneeskunde en biotechnologie, met name voor de antikanker therapie14 en vaatziekten15 alsook wat betreft de antibiotica ontwikkeling16,17, metabole aandoeningen18en19van de infecties. Er zijn meer dan honderd van kleine-peptide therapeutics klinische proeven20ondergaan. Peptiden zijn eenvoudig aan te passen en snel te synthetiseren tegen lage kosten. Daarnaast zijn ze biologisch afbreekbaar, die sterk vergemakkelijkt hun biologische en farmaceutische toepassingen21,22. Het gebruik van peptiden als structurele componenten omvat de engineering van responsieve, peptide gebaseerde nanodeeltjes en hydrogel depots voor gecontroleerde afgifte23,24,25,26 , 27, peptide gebaseerde biosensoren28,29,30,31of bio-elektronische apparaten32,33,34. Nog belangrijker is, zelfs korte peptides met twee of drie aminozuur residuen die fenylalanine bevatten bleken te begeleiden de zelf-assemblage processen35,36,,37 en maken van gestabiliseerde emulsies38 .

Platina gebaseerde drugs, vanwege hun hoge doeltreffendheid, worden gebruikt in vele kanker behandeling regimes, zowel alleen als in combinatie met andere agentia39,40. Platina verbindingen veroorzaken schade van DNA door de vorming van kruisverbindingen van monoadducts en intrastrand of interstrand. De Pt-DNA laesies worden herkend door de mobiele machine en, als niet gerepareerd, leiden tot cellulaire apoptosis. Het belangrijkste mechanisme, door die Pt(II) draagt bij aan de dood van de cel van de kanker, is de remming van de DNA transcriptie41,42. Echter worden de voordelen van platinum therapie verminderd door de systemische toxiciteit van Pt(II) die als trigger fungeert van ernstige bijwerkingen. Dit leidt tot lagere klinische doseren van Pt(II)43, wat vaak resulteert in sub therapeutische concentraties van platina bereiken van het DNA. Dientengevolge, bijdraagt de DNA-reparatie die volgt aan de overleving van de cel van de kanker en het verwerven van Pt(II) weerstand. De platina chemo-resistentie is een groot probleem in antikanker therapie en de belangrijkste oorzaak van44,45van de mislukking van de behandeling.

We hebben een stabiele nanosystem die de Pt(II) agent kapselt om te zorgen voor een beschermend effect in de systemische circulatie en vermindert de bijwerkingen Pt II-geïnduceerde ontwikkeld. Het systeem is gebaseerd op een oliezuurgehalte acids-Pt(II) kern gestabiliseerd met een KYF-tripeptide te vormen van een nanoemulsion (KYF-Pt-NE)-46. De bouwstenen van KYF-Pt-NE, de aminozuren van de tripeptide evenals de oliezuur, hebben de status van de over het algemeen erkend als Safe (GRAS) met Food and Drug Administration (FDA). De KYF-Pt-NE is bereid met behulp van een nanoprecipitation methode47. Kortom, is de geconjugeerde oliezuurgehalte acids-Pt(II) opgelost in een organisch oplosmiddel en vervolgens ontkleuring toegevoegd aan een waterige oplossing van de KYF (Figuur 1) bij 37 ° C. De oplossing wordt bewogen gedurende enkele uren om zelf-assemblage van de KYF-Pt-NE. De nanoemulsion is geconcentreerd in 10 kDa centrifugaal concentrators en drie keer gewassen met water. De chemische modificatie van de KYF met een fluorophore kunt de synthese van fluorescerende FITC-KYF-Pt-NE geschikt voor biomedische beeldbewerking.

Protocol

1. synthese van de geconjugeerde oliezuurgehalte Acids–Platinum(II) Activering van cisplatine Schorten 50 mg (0.167 mmol) cisplatine in 4 mL water (bijvoorbeeld nanopure) bij 60 ° C. Voeg dropwise 55.2 mg (0.325 mmol) van AgNO3 in 0,5 mL water aan de oplossing van cisplatine en roer de reactie voor ten minste 2 uur bij 60 ° C. Het witte neerslag van AgCl zal vormen die de voortgang van de reactie aangeeft. Om te bepalen als de reactie van de activering is voltooid, h…

Representative Results

Vertegenwoordiger TEM afbeelding van KYF-Pt-NE opgesteld op basis van dit protocol wordt getoond in figuur 2A. De KYF-Pt-NEs zijn bolvormig in morfologie, goed verspreid, en uniform in grootte. De kerndiameter van de KYF-Pt-NEs, gemeten vanuit drie TEM beelden met een minimum van 200 metingen gedaan, is 107 ± 27 nm. De hydrodynamische diameter van KYF-Pt-NE, geanalyseerd met behulp van dynamische lichte spectroscopie (DLS), bleek te zijn 240 nm met een polyd…

Discussion

Kritische stappen in de nanoemulsion synthese omvatten aanpassing van de molaire verhouding van de substraten, temperatuur en debiet tarief controle houden tijdens oliezuurgehalte acids–Pt(II) toevoeging bieden voldoende tijd voor zelf-assemblage en zuiveren met behulp van het product een Centrifugaal concentrator kolom. Deze parameters invloed op de grootte en morfologie van de KYF-Pt-NE; het is dus belangrijk de juiste molaire verhouding te handhaven en de synthetische voorwaarden correct aan te passen.

<p class=…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij nogmaals mijn dankbaarheid uitspreken financiële steun van de National Cancer Institute, verlenen SC2CA206194. Geen concurrerende financiële belangen worden gedeclareerd.

Materials

2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
  2. Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (1), 10-29 (2016).
  3. Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature Nanotechnology. 2 (12), 751-760 (2007).
  4. Roy Chowdhury, M., Schumann, C., Bhakta-Guha, D., Guha, G. Cancer nanotheranostics: Strategies, promises and impediments. Biomedicine & Pharmacotherapy. 84, 291-304 (2016).
  5. Jeevanandam, J., Chan, Y. S., Danquah, M. K. Nano-formulations of drugs: Recent developments, impact and challenges. Biochimie. , 99-112 (2016).
  6. Meerum Terwogt, J. M., Groenewegen, G., Pluim, D., Maliepaard, M., Tibben, M. M., Huisman, A., ten Bokkel Huinink, W. W., Schot, M., Welbank, H., Voest, E. E., Beijnen, J. H., Schellens, J. M. Phase I and pharmacokinetic study of SPI-77, a liposomal encapsulated dosage form of cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 49 (3), 201-210 (2002).
  7. Fan, Z., Sun, L., Huang, Y., Wang, Y., Zhang, M. Bioinspired fluorescent dipeptide nanoparticles for targeted cancer cell imaging and real-time monitoring of drug release. Nature Nanotechnology. 11 (4), 388-394 (2016).
  8. Jeong, Y., et al. Enzymatically degradable temperature-sensitive polypeptide as a new in-situ gelling biomaterial. Journal of Controlled Release. 137 (1), 25-30 (2009).
  9. Uesaka, A., et al. Morphology control between twisted ribbon, helical ribbon, and nanotube self-assemblies with his-containing helical peptides in response to pH change. Langmuir. 30 (4), 1022-1028 (2014).
  10. Hwang, W., Marini, D. M., Kamm, R. D., Zhang, S. Supramolecular structure of helical ribbons self-assembled from a B-sheet peptide. Journal of Chemical Physics. 118 (1), 389-397 (2003).
  11. Svobodova, J., et al. Poly(amino acid)-based fibrous scaffolds modified with surface-pendant peptides for cartilage tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 831-842 (2017).
  12. Kumar, V. A., et al. Highly angiogenic peptide nanofibers. ACS Nano. 9 (1), 860-868 (2015).
  13. Romera, D., Couleaud, P., Mejias, S. H., Aires, A., Cortajarena, A. L. Biomolecular templating of functional hybrid nanostructures using repeat protein scaffolds. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 825-831 (2015).
  14. Medina, S. H., Schneider, J. P. Cancer cell surface induced peptide folding allows intracellular translocation of drug. Journal of Controlled Release. 209, 317-326 (2015).
  15. Recio, C., Maione, F., Iqbal, A. J., Mascolo, N., De Feo, V. The Potential Therapeutic Application of Peptides and Peptidomimetics in Cardiovascular Disease. Frontiers in Pharmacology. 7, 526 (2016).
  16. McCarthy, K. A., et al. Phage Display of Dynamic Covalent Binding Motifs Enables Facile Development of Targeted Antibiotics. Journal of the American Chemical Society. 140 (19), 6137-6145 (2018).
  17. Lazar, V., et al. Antibiotic-resistant bacteria show widespread collateral sensitivity to antimicrobial peptides. Nature Microbiology. 3 (6), 718-731 (2018).
  18. Czeczor, J. K., McGee, S. L. Emerging roles for the amyloid precursor protein and derived peptides in the regulation of cellular and systemic metabolism. Journal of Neuroendocrinology. 29 (5), (2017).
  19. Branco, M. C., Sigano, D. M., Schneider, J. P. Materials from peptide assembly: towards the treatment of cancer and transmittable disease. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (3), 427-434 (2011).
  20. Cheetham, A. G., et al. Targeting Tumors with Small Molecule Peptides. Current Cancer Drug Targets. 16 (6), 489-508 (2016).
  21. Ndinguri, M. W., Solipuram, R., Gambrell, R. P., Aggarwal, S., Hammer, R. P. Peptide targeting of platinum anti-cancer drugs. Bioconjugate Chemistry. 20 (10), 1869-1878 (2009).
  22. Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I., Stephenson, R. J. Recent advances in self-assembled peptides: Implications for targeted drug delivery and vaccine engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 110, 169-187 (2017).
  23. Zhou, J., Du, X., Yamagata, N., Xu, B. Enzyme-Instructed Self-Assembly of Small D-Peptides as a Multiple-Step Process for Selectively Killing Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (11), 3813-3823 (2016).
  24. Sun, J. E., et al. Sustained release of active chemotherapeutics from injectable-solid beta-hairpin peptide hydrogel. Biomaterials Science. 4 (5), 839-848 (2016).
  25. Lock, L. L., Reyes, C. D., Zhang, P., Cui, H. Tuning Cellular Uptake of Molecular Probes by Rational Design of Their Assembly into Supramolecular Nanoprobes. Journal of the American Chemical Society. 138 (10), 3533-3540 (2016).
  26. Kalafatovic, D., Nobis, M., Son, J., Anderson, K. I., Ulijn, R. V. MMP-9 triggered self-assembly of doxorubicin nanofiber depots halts tumor growth. Biomaterials. 98, 192-202 (2016).
  27. Frederix, P. W., et al. Exploring the sequence space for (tri-)peptide self-assembly to design and discover new hydrogels. Nature Chemistry. 7 (1), 30-37 (2015).
  28. Horsley, J. R., et al. Photoswitchable peptide-based ‘on-off’ biosensor for electrochemical detection and control of protein-protein interactions. Biosensors and Bioelectronics. 118, 188-194 (2018).
  29. Hoyos-Nogues, M., Gil, F. J., Mas-Moruno, C. Antimicrobial Peptides: Powerful Biorecognition Elements to Detect Bacteria in Biosensing Technologies. Molecules. 23 (7), 1683 (2018).
  30. Xiao, X., et al. Advancing Peptide-Based Biorecognition Elements for Biosensors Using in-Silico Evolution. ACS Sensors. 3 (5), 1024-1031 (2018).
  31. Puiu, M., Bala, C. Peptide-based biosensors: From self-assembled interfaces to molecular probes in electrochemical assays. Bioelectrochemistry. 120, 66-75 (2018).
  32. Wang, J., et al. Developing a capillary electrophoresis based method for dynamically monitoring enzyme cleavage activity using quantum dots-peptide assembly. Electrophoresis. 38 (19), 2530-2535 (2017).
  33. Etayash, H., Thundat, T., Kaur, K. Bacterial Detection Using Peptide-Based Platform and Impedance Spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1572, 113-124 (2017).
  34. Handelman, A., Apter, B., Shostak, T., Rosenman, G. Peptide Optical waveguides. Journal of Peptide Science. 23 (2), 95-103 (2017).
  35. Chen, C., Liu, K., Li, J., Yan, X. Functional architectures based on self-assembly of bio-inspired dipeptides: Structure modulation and its photoelectronic applications. Advances in Colloid and Interface Science. 225, 177-193 (2015).
  36. Reddy, S. M., Shanmugam, G. Role of Intramolecular Aromatic pi-pi Interactions in the Self-Assembly of Di-l-Phenylalanine Dipeptide Driven by Intermolecular Interactions: Effect of Alanine Substitution. Chemphyschem. 17 (18), 2897-2907 (2016).
  37. Marchesan, S., et al. Unzipping the role of chirality in nanoscale self-assembly of tripeptide hydrogels. Nanoscale. 4 (21), 6752-6760 (2012).
  38. Scott, G. G., McKnight, P. J., Tuttle, T., Ulijn, R. V. Tripeptide Emulsifiers. Advanced Materials. 28 (7), 1381-1386 (2016).
  39. Galanski, M., Jakupec, M. A., Keppler, B. K. Update of the preclinical situation of anticancer platinum complexes: novel design strategies and innovative analytical approaches. Current Medicinal Chemistry. 12 (18), 2075-2094 (2005).
  40. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  41. Oberoi, H. S., Nukolova, N. V., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Nanocarriers for delivery of platinum anticancer drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (13-14), 1667-1685 (2013).
  42. Fichtinger-Schepman, A. M., van Oosterom, A. T., Lohman, P. H., Berends, F. cis-Diamminedichloroplatinum(II)-induced DNA adducts in peripheral leukocytes from seven cancer patients: quantitative immunochemical detection of the adduct induction and removal after a single dose of cis-diamminedichloroplatinum(II). Cancer Research. 47 (11), 3000-3004 (1987).
  43. Englander, E. W. DNA damage response in peripheral nervous system: coping with cancer therapy-induced DNA lesions. DNA Repair. 12 (8), 685-690 (2013).
  44. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene. 31 (15), 1869-1883 (2012).
  45. Boeckman, H. J., Trego, K. S., Turchi, J. J. Cisplatin sensitizes cancer cells to ionizing radiation via inhibition of nonhomologous end joining. Molecular Cancer Research. 3 (5), 277-285 (2005).
  46. Dragulska, S. A., et al. Tripeptide-Stabilized Oil-in-Water Nanoemulsion of an Oleic Acids-Platinum(II) Conjugate as an Anticancer Nanomedicine. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2514-2519 (2018).
  47. Martinez Rivas, ., J, C., et al. Nanoprecipitation process: From encapsulation to drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 532 (1), 66-81 (2017).
  48. Agilent Technologies. . Analytical Methods for Graphite Tube Atomizers, User’s Guide Manual, 8th edition. , (2012).
  49. Park, S. Y., et al. A smart polysaccharide/drug conjugate for photodynamic therapy. Angewandte Chemie. 50 (7), 1644-1647 (2011).
  50. Canton, I., Battaglia, G. Endocytosis at the nanoscale. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2718-2739 (2012).
  51. Lokich, J., Anderson, N. Carboplatin versus cisplatin in solid tumors: an analysis of the literature. Annals of Oncology. 9 (1), 13-21 (1998).

Tags

TripeptideNanoemulsionOleic AcidCisplatinPlatinumOvarian CancerPeptide ModificationDiagnosticPharmaceuticalIn-vivo StudiesFmocL-phenylalanineL-tyrosineTBTUDIPEA
check_url/59034?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image