פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לסנתז את nanoemulsion של המספר המשלים acids-platinum(II) האולאית התייצב עם tripeptide ליזין-טירוזין-פנילאלנין (KYF). הצורות nanoemulsion בתנאים סינתטי קלה באמצעות הרכבה עצמית של KYF, לחשב את המשלים שלו.
אנו מתארים שיטה לייצר nanoemulsion המורכב על ליבה acids-Pt(II) האולאית וציפוי של ליזין-טירוזין-פנילאלנין (KYF) (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE מכמס Pt(II) ב- 10 wt. %, קוטרו של 107 ± 27 ננומטר, משטח מטען שלילי. KYF-Pt-NE יציב תוך סרום, פעילים ביולוגית. הבניין של fluorophore כדי KYF מאפשרת הסינתזה של nanoemulsion פלורסנט המתאימה עבור הדמיה ביולוגי. הסינתזה של nanoemulsion מתבצע בסביבה מימית, ולא הצורות KYF-Pt-NE באמצעות הרכבה עצמית של פפטיד KYF קצר ואת המספר של acids-platinum(II) האולאית המשלים. תהליך הרכבה עצמית תלויה על הטמפרטורה של הפתרון, יחס טוחנת סובסטרטים, קצב הזרימה של התוספת המצע. שלבים קריטיים כוללים שמירה על קצב מלהיב אופטימלית במהלך הסינתזה, המתיר מספיק זמן עבור הרכבה עצמית, ריכוז מראש את nanoemulsion בהדרגה ברכז צנטריפוגלי.
בשנים האחרונות חלה עניין הולך וגובר בתחומי ההנדסה של חלקיקים כאלה ביו יישומים כמו תרופות ו-3,2,1,bioimaging4. Multifunctionality של מערכות מבוססות nanoparticle מחייבת לעתים קרובות שילוב רכיבים מרובים בתוך אחד ניסוח. אבני הבניין המבוססים על שומנים או פולימרים לעיתים קרובות שונים מבחינת תכונותיהם physicochemical וכן הביו שלהם, biodegradability, דבר שבסופו של דבר שעשוי להשפיע על הפונקציה של ננו-מבנה1, 5,6. חומרים נגזרת ביולוגית, כגון חלבונים ופפטידים, זמן הוכרו מבטיח מרכיבי nanostructures רב תכליתיים עקב שלהם רצף גמישות7,8. פפטידים בעצמם לתוך מאוד מסודרת ארכיטקטורות סופרא מולקולרית ויוצרים לוליינית סרטים9,10, פיגומים סיביים11,12, ועוד רבים, ובכך לסלול את הדרך לבניין nanostructures מבוססי biomolecule היברידית באמצעות מלמטה-למעלה הגישה13.
פפטידים נחקרו עבור יישומים ברפואה וביוטכנולוגיה, במיוחד עבור טיפול נגד סרטן14 ו מחלות לב וכלי דם15 גם לגבי פיתוח אנטיביוטי16,17, מטבולית הפרעות18ולאחר זיהומים19. יש יותר ממאה של קטן-פפטיד הרפוי שעברו ניסויים קליניים20. פפטידים נמצאים קל לשנות מהר לסנתז במחיר נמוך. בנוסף, הם חומר מתכלה, אשר מקל מאוד21,שלהם יישומים ביולוגיים ובתחום הרוקחות22. השימוש של פפטידים רכיבים מבניים כולל ההנדסה של חלקיקים מגיב, מבוססת על פפטיד, מחסני הידרוג עבור שחרור מבוקר23,24,25,26 , 27, ביולוגיים מבוססת על פפטיד28,29,30,31או התקנים ביו-אלקטרוניקה-32,–33,–34. חשוב, פפטידים קצרים אפילו עם שאריות חומצה אמינית שניים או שלושה, הכוללים פנילאלנין נמצאו להנחות תהליכי35,36,37 וליצור מיוצב אמולסיות38 הרכבה עצמית .
תרופות מבוססת פלטינה, בשל יעילות גבוהה שלהם, משמשים משטרי הטיפול רבים של סרטן, גם לבד וגם בשילוב עם סוכנים אחרים,39,40. תרכובות פלטינה לגרום נזק לדנ א על ידי יצירת חוצה קישורים monoadducts, intrastrand או interstrand. נגעים Pt-DNA מזוהים על ידי המנגנונים הסלולר ו, אם לא יתוקן, להוביל אפופטוזיס הסלולר. המנגנון החשוב ביותר, שבו Pt(II) תורמת מוות תאי סרטן, הוא עיכוב של ה-DNA שעתוק41,42. עם זאת, היתרונות של טיפול פלטינה הם הצטמצמו מאת מערכתית רעילות Pt(II) שמפעיל תופעות לוואי חמורות. זה מוביל מינון נמוך יותר קליני של Pt(II)43, אשר לעתים קרובות התוצאות מתחת לרמה תרפויטית ריכוזי פלטינה לכת ה-DNA. כתוצאה מכך, תיקון ה-DNA כי בעקבות תורמת הישרדות cell סרטן ורכישת ההתנגדות Pt(II). הכימותרפיה-ההתנגדות פלטינה היא בעיה רצינית טיפול נגד סרטן, הגורם העיקרי של הטיפול כשל44,45.
פיתחנו nanosystem יציב המכיל את הסוכן Pt(II) על מנת לספק אפקט מיגון ב מחזור מערכתי, להפחית את תופעות הלוואי Pt II-induced. המערכת מבוססת על ליבת acids-Pt(II) האולאית התייצב עם tripeptide KYF כדי ליצור את nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46. אבני הבניין של KYF-Pt-NE, חומצות אמינו tripeptide, כמו גם של חומצה אולאית, בעלי מעמד בדרך כלל מזוהה בתור בטוחה (גרא) ועם המזון והתרופות האמריקני (FDA). KYF-Pt-NE מוכן באמצעות שיטה של nanoprecipitation47. בקיצור, המספר המשלים acids-Pt(II) אולאית הוא מומס של הממס האורגני ולאחר מכן נוסף dropwise פתרון KYF מימית (איור 1) ב- 37 מעלות צלזיוס. הפתרון הוא זז במשך מספר שעות לאפשר הרכבה עצמית של KYF-Pt-נברסקה Nanoemulsion זה מרוכזים 10 רכזים צנטריפוגלי kDa ושטף שלוש פעמים עם מים. שינוי כימי של KYF עם fluorophore מאפשרת הסינתזה של פלורסנט FITC-KYF-Pt-NE מתאימים עבור הדמיה הביו-רפואית.
השלבים הקריטיים של הסינתזה nanoemulsion כוללים התאמת יחס טוחנת סובסטרטים, שמירה על טמפרטורה וזרימת בקרת קצב במהלך הוספת acids–Pt(II) האולאית, מתן זמן מספיק הרכבה עצמית, מטהרים את המוצר באמצעות רכז צנטריפוגלי טורים. פרמטרים אלה משפיעים על גודל של המורפולוגיה של KYF-Pt-ששומר; לכן, חשוב במיוחד לשמור על יח?…
The authors have nothing to disclose.
אנו להכיר בהכרת תודה תמיכה כספית נדיבה של המכון הלאומי לסרטן, הענק SC2CA206194. אין אינטרסים כלכליים מתחרים מוצהרים.
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) |
ANASPEC INC.: | AS-20376 | SPPS |
4-well chamber confocal dish | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific | 154526 | For imaging |
6-bromohexanoic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 24477 | Click modification for peptide |
A2780 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Barnstead Nanopure | Thermo Fisher | D11901 | water filtration system |
BUCHI rotavapor R-3 | Buchi | Z568090 | For solvent removal and sample drying |
Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811F | For platinum complex separation |
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | in vitro tests |
CP70 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Digital water bath | VWR | 97025-134 | For warming up media for cell culture |
Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instrument Corporation | For nanoparticle size measurments | |
ES-2 | ATCC | CRL-1978 | ovarian cancer cell line |
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% | Chem-Impex INT’L INC. | 00493 | SPPS |
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), | Chem-Impex INT’L INC. | 01914 | SPPS |
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
HERACELL 150i CO2 incubator | Thermo Scientific Fisher | incubator | |
High pressure syringe pump | New Era | 1010-US | For platinum complex addition in nanoparticle synthesis |
Hotplate/stirrer | VWR | 12365-382 | For sample stirring and heating |
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | For imaging |
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Oakwood Chemical | 005027 | SPPS |
Ninhydrin 99% | Alfa Aesar | A10409 | Kaiser test |
Oleic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 01421 | For platinum complex synthesis |
OV90 | ATCC | CRL-11732 | Ovarian cancer cell line |
PBS | Corning | 21-031-CV | For cell wash |
Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-100 | For imaging |
Phenol | Fisher Chemical | A92500 | Kaiser test |
Phosphotungstic acid | Fisher Chemical | A248-25 | negative stain for TEM |
Piperidine 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
Platinum AAS standard soultion | Alfa Aesar | 88086 | 1000ug/ml for calibration curve |
Propargyl bromide 97% | Alfa Aesar | L10595 | For alkyne modification of fluoresceine |
Scientific biological cabinet | Thermo Scientific Fisher | 1385 | Bio-hood for cell culture |
Self-Cleaning Vacuum System | Welch | 2028 | Vacuum pump for rotavapor |
Silver nitrate | Acros Organics | 19768-0250 | Cisplatin activation |
SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Ovarian cancer cell line |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S313-1 | For platinum complex synthesis |
Tin (II) chloride | Sigma Aldrich | 208256 | Test for Platinum presence |
TOV21G | ATCC | CRL-11730 | Ovarian cancer cell line |
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
Triisopropylsilane (TIPS) | Chem-Impex INT’L INC. | 01966 | SPPS |
Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | For imaging |
Uranine powder 40% | Fisher Scientific | S25328A | For alkyne modification of fluoresceine |
Vivaspin 20 (10000 MWCO) | Sartorious | VS2001 | For Nanoparticle wash and condensation |
VWR Inverted Microscope | VWR | 89404-462 | For cell culture monitoring |