Summary

Nanoemulsion מיוצב Tripeptide של חומצה אולאית

Published: February 27, 2019
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לסנתז את nanoemulsion של המספר המשלים acids-platinum(II) האולאית התייצב עם tripeptide ליזין-טירוזין-פנילאלנין (KYF). הצורות nanoemulsion בתנאים סינתטי קלה באמצעות הרכבה עצמית של KYF, לחשב את המשלים שלו.

Abstract

אנו מתארים שיטה לייצר nanoemulsion המורכב על ליבה acids-Pt(II) האולאית וציפוי של ליזין-טירוזין-פנילאלנין (KYF) (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE מכמס Pt(II) ב- 10 wt. %, קוטרו של 107 ± 27 ננומטר, משטח מטען שלילי. KYF-Pt-NE יציב תוך סרום, פעילים ביולוגית. הבניין של fluorophore כדי KYF מאפשרת הסינתזה של nanoemulsion פלורסנט המתאימה עבור הדמיה ביולוגי. הסינתזה של nanoemulsion מתבצע בסביבה מימית, ולא הצורות KYF-Pt-NE באמצעות הרכבה עצמית של פפטיד KYF קצר ואת המספר של acids-platinum(II) האולאית המשלים. תהליך הרכבה עצמית תלויה על הטמפרטורה של הפתרון, יחס טוחנת סובסטרטים, קצב הזרימה של התוספת המצע. שלבים קריטיים כוללים שמירה על קצב מלהיב אופטימלית במהלך הסינתזה, המתיר מספיק זמן עבור הרכבה עצמית, ריכוז מראש את nanoemulsion בהדרגה ברכז צנטריפוגלי.

Introduction

בשנים האחרונות חלה עניין הולך וגובר בתחומי ההנדסה של חלקיקים כאלה ביו יישומים כמו תרופות ו-3,2,1,bioimaging4. Multifunctionality של מערכות מבוססות nanoparticle מחייבת לעתים קרובות שילוב רכיבים מרובים בתוך אחד ניסוח. אבני הבניין המבוססים על שומנים או פולימרים לעיתים קרובות שונים מבחינת תכונותיהם physicochemical וכן הביו שלהם, biodegradability, דבר שבסופו של דבר שעשוי להשפיע על הפונקציה של ננו-מבנה1, 5,6. חומרים נגזרת ביולוגית, כגון חלבונים ופפטידים, זמן הוכרו מבטיח מרכיבי nanostructures רב תכליתיים עקב שלהם רצף גמישות7,8. פפטידים בעצמם לתוך מאוד מסודרת ארכיטקטורות סופרא מולקולרית ויוצרים לוליינית סרטים9,10, פיגומים סיביים11,12, ועוד רבים, ובכך לסלול את הדרך לבניין nanostructures מבוססי biomolecule היברידית באמצעות מלמטה-למעלה הגישה13.

פפטידים נחקרו עבור יישומים ברפואה וביוטכנולוגיה, במיוחד עבור טיפול נגד סרטן14 ו מחלות לב וכלי דם15 גם לגבי פיתוח אנטיביוטי16,17, מטבולית הפרעות18ולאחר זיהומים19. יש יותר ממאה של קטן-פפטיד הרפוי שעברו ניסויים קליניים20. פפטידים נמצאים קל לשנות מהר לסנתז במחיר נמוך. בנוסף, הם חומר מתכלה, אשר מקל מאוד21,שלהם יישומים ביולוגיים ובתחום הרוקחות22. השימוש של פפטידים רכיבים מבניים כולל ההנדסה של חלקיקים מגיב, מבוססת על פפטיד, מחסני הידרוג עבור שחרור מבוקר23,24,25,26 , 27, ביולוגיים מבוססת על פפטיד28,29,30,31או התקנים ביו-אלקטרוניקה-32,33,34. חשוב, פפטידים קצרים אפילו עם שאריות חומצה אמינית שניים או שלושה, הכוללים פנילאלנין נמצאו להנחות תהליכי35,36,37 וליצור מיוצב אמולסיות38 הרכבה עצמית .

תרופות מבוססת פלטינה, בשל יעילות גבוהה שלהם, משמשים משטרי הטיפול רבים של סרטן, גם לבד וגם בשילוב עם סוכנים אחרים,39,40. תרכובות פלטינה לגרום נזק לדנ א על ידי יצירת חוצה קישורים monoadducts, intrastrand או interstrand. נגעים Pt-DNA מזוהים על ידי המנגנונים הסלולר ו, אם לא יתוקן, להוביל אפופטוזיס הסלולר. המנגנון החשוב ביותר, שבו Pt(II) תורמת מוות תאי סרטן, הוא עיכוב של ה-DNA שעתוק41,42. עם זאת, היתרונות של טיפול פלטינה הם הצטמצמו מאת מערכתית רעילות Pt(II) שמפעיל תופעות לוואי חמורות. זה מוביל מינון נמוך יותר קליני של Pt(II)43, אשר לעתים קרובות התוצאות מתחת לרמה תרפויטית ריכוזי פלטינה לכת ה-DNA. כתוצאה מכך, תיקון ה-DNA כי בעקבות תורמת הישרדות cell סרטן ורכישת ההתנגדות Pt(II). הכימותרפיה-ההתנגדות פלטינה היא בעיה רצינית טיפול נגד סרטן, הגורם העיקרי של הטיפול כשל44,45.

פיתחנו nanosystem יציב המכיל את הסוכן Pt(II) על מנת לספק אפקט מיגון ב מחזור מערכתי, להפחית את תופעות הלוואי Pt II-induced. המערכת מבוססת על ליבת acids-Pt(II) האולאית התייצב עם tripeptide KYF כדי ליצור את nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46. אבני הבניין של KYF-Pt-NE, חומצות אמינו tripeptide, כמו גם של חומצה אולאית, בעלי מעמד בדרך כלל מזוהה בתור בטוחה (גרא) ועם המזון והתרופות האמריקני (FDA). KYF-Pt-NE מוכן באמצעות שיטה של nanoprecipitation47. בקיצור, המספר המשלים acids-Pt(II) אולאית הוא מומס של הממס האורגני ולאחר מכן נוסף dropwise פתרון KYF מימית (איור 1) ב- 37 מעלות צלזיוס. הפתרון הוא זז במשך מספר שעות לאפשר הרכבה עצמית של KYF-Pt-נברסקה Nanoemulsion זה מרוכזים 10 רכזים צנטריפוגלי kDa ושטף שלוש פעמים עם מים. שינוי כימי של KYF עם fluorophore מאפשרת הסינתזה של פלורסנט FITC-KYF-Pt-NE מתאימים עבור הדמיה הביו-רפואית.

Protocol

1. סינתזה של המספר המשלים Acids–Platinum(II) האולאית הפעלה של ציספלטין להשעות 50 מ”ג (0.167 mmol) של ציספלטין ב 4 מ ל מים (למשל, nanopure) ב 60 מעלות צלזיוס. הוספת dropwise 55.2 מ”ג (0.325 mmol) AgNO3 0.5 מיליליטר מים אל הפתרון של ציספלטין ומערבבים את התגובה כבר לפחות שעתיים ב 60 מעלות צלזיוס. התמיסה לבן של AgCl …

Representative Results

תמונת TEM נציג של KYF-Pt-NE שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה מוצג באיור 2A. KYF-Pt-נס הם כדורי במורפולוגיה, ובכן התפזרו, אחידים בגודלם. הקוטר הליבה של KYF-Pt-נס, נמדדו ישירות מתוך שלוש תמונות TEM עם מינימום של 200 מידות הכבוד, הוא 107 ± 27 ננומטר. הקוטר hydrodynamic של KYF-Pt-NE, נותחה באמצעות …

Discussion

השלבים הקריטיים של הסינתזה nanoemulsion כוללים התאמת יחס טוחנת סובסטרטים, שמירה על טמפרטורה וזרימת בקרת קצב במהלך הוספת acids–Pt(II) האולאית, מתן זמן מספיק הרכבה עצמית, מטהרים את המוצר באמצעות רכז צנטריפוגלי טורים. פרמטרים אלה משפיעים על גודל של המורפולוגיה של KYF-Pt-ששומר; לכן, חשוב במיוחד לשמור על יח?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו להכיר בהכרת תודה תמיכה כספית נדיבה של המכון הלאומי לסרטן, הענק SC2CA206194. אין אינטרסים כלכליים מתחרים מוצהרים.

Materials

2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)
ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring

References

  1. Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
  2. Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (1), 10-29 (2016).
  3. Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature Nanotechnology. 2 (12), 751-760 (2007).
  4. Roy Chowdhury, M., Schumann, C., Bhakta-Guha, D., Guha, G. Cancer nanotheranostics: Strategies, promises and impediments. Biomedicine & Pharmacotherapy. 84, 291-304 (2016).
  5. Jeevanandam, J., Chan, Y. S., Danquah, M. K. Nano-formulations of drugs: Recent developments, impact and challenges. Biochimie. , 99-112 (2016).
  6. Meerum Terwogt, J. M., Groenewegen, G., Pluim, D., Maliepaard, M., Tibben, M. M., Huisman, A., ten Bokkel Huinink, W. W., Schot, M., Welbank, H., Voest, E. E., Beijnen, J. H., Schellens, J. M. Phase I and pharmacokinetic study of SPI-77, a liposomal encapsulated dosage form of cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 49 (3), 201-210 (2002).
  7. Fan, Z., Sun, L., Huang, Y., Wang, Y., Zhang, M. Bioinspired fluorescent dipeptide nanoparticles for targeted cancer cell imaging and real-time monitoring of drug release. Nature Nanotechnology. 11 (4), 388-394 (2016).
  8. Jeong, Y., et al. Enzymatically degradable temperature-sensitive polypeptide as a new in-situ gelling biomaterial. Journal of Controlled Release. 137 (1), 25-30 (2009).
  9. Uesaka, A., et al. Morphology control between twisted ribbon, helical ribbon, and nanotube self-assemblies with his-containing helical peptides in response to pH change. Langmuir. 30 (4), 1022-1028 (2014).
  10. Hwang, W., Marini, D. M., Kamm, R. D., Zhang, S. Supramolecular structure of helical ribbons self-assembled from a B-sheet peptide. Journal of Chemical Physics. 118 (1), 389-397 (2003).
  11. Svobodova, J., et al. Poly(amino acid)-based fibrous scaffolds modified with surface-pendant peptides for cartilage tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 831-842 (2017).
  12. Kumar, V. A., et al. Highly angiogenic peptide nanofibers. ACS Nano. 9 (1), 860-868 (2015).
  13. Romera, D., Couleaud, P., Mejias, S. H., Aires, A., Cortajarena, A. L. Biomolecular templating of functional hybrid nanostructures using repeat protein scaffolds. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 825-831 (2015).
  14. Medina, S. H., Schneider, J. P. Cancer cell surface induced peptide folding allows intracellular translocation of drug. Journal of Controlled Release. 209, 317-326 (2015).
  15. Recio, C., Maione, F., Iqbal, A. J., Mascolo, N., De Feo, V. The Potential Therapeutic Application of Peptides and Peptidomimetics in Cardiovascular Disease. Frontiers in Pharmacology. 7, 526 (2016).
  16. McCarthy, K. A., et al. Phage Display of Dynamic Covalent Binding Motifs Enables Facile Development of Targeted Antibiotics. Journal of the American Chemical Society. 140 (19), 6137-6145 (2018).
  17. Lazar, V., et al. Antibiotic-resistant bacteria show widespread collateral sensitivity to antimicrobial peptides. Nature Microbiology. 3 (6), 718-731 (2018).
  18. Czeczor, J. K., McGee, S. L. Emerging roles for the amyloid precursor protein and derived peptides in the regulation of cellular and systemic metabolism. Journal of Neuroendocrinology. 29 (5), (2017).
  19. Branco, M. C., Sigano, D. M., Schneider, J. P. Materials from peptide assembly: towards the treatment of cancer and transmittable disease. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (3), 427-434 (2011).
  20. Cheetham, A. G., et al. Targeting Tumors with Small Molecule Peptides. Current Cancer Drug Targets. 16 (6), 489-508 (2016).
  21. Ndinguri, M. W., Solipuram, R., Gambrell, R. P., Aggarwal, S., Hammer, R. P. Peptide targeting of platinum anti-cancer drugs. Bioconjugate Chemistry. 20 (10), 1869-1878 (2009).
  22. Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I., Stephenson, R. J. Recent advances in self-assembled peptides: Implications for targeted drug delivery and vaccine engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 110, 169-187 (2017).
  23. Zhou, J., Du, X., Yamagata, N., Xu, B. Enzyme-Instructed Self-Assembly of Small D-Peptides as a Multiple-Step Process for Selectively Killing Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (11), 3813-3823 (2016).
  24. Sun, J. E., et al. Sustained release of active chemotherapeutics from injectable-solid beta-hairpin peptide hydrogel. Biomaterials Science. 4 (5), 839-848 (2016).
  25. Lock, L. L., Reyes, C. D., Zhang, P., Cui, H. Tuning Cellular Uptake of Molecular Probes by Rational Design of Their Assembly into Supramolecular Nanoprobes. Journal of the American Chemical Society. 138 (10), 3533-3540 (2016).
  26. Kalafatovic, D., Nobis, M., Son, J., Anderson, K. I., Ulijn, R. V. MMP-9 triggered self-assembly of doxorubicin nanofiber depots halts tumor growth. Biomaterials. 98, 192-202 (2016).
  27. Frederix, P. W., et al. Exploring the sequence space for (tri-)peptide self-assembly to design and discover new hydrogels. Nature Chemistry. 7 (1), 30-37 (2015).
  28. Horsley, J. R., et al. Photoswitchable peptide-based ‘on-off’ biosensor for electrochemical detection and control of protein-protein interactions. Biosensors and Bioelectronics. 118, 188-194 (2018).
  29. Hoyos-Nogues, M., Gil, F. J., Mas-Moruno, C. Antimicrobial Peptides: Powerful Biorecognition Elements to Detect Bacteria in Biosensing Technologies. Molecules. 23 (7), 1683 (2018).
  30. Xiao, X., et al. Advancing Peptide-Based Biorecognition Elements for Biosensors Using in-Silico Evolution. ACS Sensors. 3 (5), 1024-1031 (2018).
  31. Puiu, M., Bala, C. Peptide-based biosensors: From self-assembled interfaces to molecular probes in electrochemical assays. Bioelectrochemistry. 120, 66-75 (2018).
  32. Wang, J., et al. Developing a capillary electrophoresis based method for dynamically monitoring enzyme cleavage activity using quantum dots-peptide assembly. Electrophoresis. 38 (19), 2530-2535 (2017).
  33. Etayash, H., Thundat, T., Kaur, K. Bacterial Detection Using Peptide-Based Platform and Impedance Spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1572, 113-124 (2017).
  34. Handelman, A., Apter, B., Shostak, T., Rosenman, G. Peptide Optical waveguides. Journal of Peptide Science. 23 (2), 95-103 (2017).
  35. Chen, C., Liu, K., Li, J., Yan, X. Functional architectures based on self-assembly of bio-inspired dipeptides: Structure modulation and its photoelectronic applications. Advances in Colloid and Interface Science. 225, 177-193 (2015).
  36. Reddy, S. M., Shanmugam, G. Role of Intramolecular Aromatic pi-pi Interactions in the Self-Assembly of Di-l-Phenylalanine Dipeptide Driven by Intermolecular Interactions: Effect of Alanine Substitution. Chemphyschem. 17 (18), 2897-2907 (2016).
  37. Marchesan, S., et al. Unzipping the role of chirality in nanoscale self-assembly of tripeptide hydrogels. Nanoscale. 4 (21), 6752-6760 (2012).
  38. Scott, G. G., McKnight, P. J., Tuttle, T., Ulijn, R. V. Tripeptide Emulsifiers. Advanced Materials. 28 (7), 1381-1386 (2016).
  39. Galanski, M., Jakupec, M. A., Keppler, B. K. Update of the preclinical situation of anticancer platinum complexes: novel design strategies and innovative analytical approaches. Current Medicinal Chemistry. 12 (18), 2075-2094 (2005).
  40. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  41. Oberoi, H. S., Nukolova, N. V., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Nanocarriers for delivery of platinum anticancer drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (13-14), 1667-1685 (2013).
  42. Fichtinger-Schepman, A. M., van Oosterom, A. T., Lohman, P. H., Berends, F. cis-Diamminedichloroplatinum(II)-induced DNA adducts in peripheral leukocytes from seven cancer patients: quantitative immunochemical detection of the adduct induction and removal after a single dose of cis-diamminedichloroplatinum(II). Cancer Research. 47 (11), 3000-3004 (1987).
  43. Englander, E. W. DNA damage response in peripheral nervous system: coping with cancer therapy-induced DNA lesions. DNA Repair. 12 (8), 685-690 (2013).
  44. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene. 31 (15), 1869-1883 (2012).
  45. Boeckman, H. J., Trego, K. S., Turchi, J. J. Cisplatin sensitizes cancer cells to ionizing radiation via inhibition of nonhomologous end joining. Molecular Cancer Research. 3 (5), 277-285 (2005).
  46. Dragulska, S. A., et al. Tripeptide-Stabilized Oil-in-Water Nanoemulsion of an Oleic Acids-Platinum(II) Conjugate as an Anticancer Nanomedicine. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2514-2519 (2018).
  47. Martinez Rivas, ., J, C., et al. Nanoprecipitation process: From encapsulation to drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 532 (1), 66-81 (2017).
  48. Agilent Technologies. . Analytical Methods for Graphite Tube Atomizers, User’s Guide Manual, 8th edition. , (2012).
  49. Park, S. Y., et al. A smart polysaccharide/drug conjugate for photodynamic therapy. Angewandte Chemie. 50 (7), 1644-1647 (2011).
  50. Canton, I., Battaglia, G. Endocytosis at the nanoscale. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2718-2739 (2012).
  51. Lokich, J., Anderson, N. Carboplatin versus cisplatin in solid tumors: an analysis of the literature. Annals of Oncology. 9 (1), 13-21 (1998).
check_url/59034?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).

View Video