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Bioengineering

Une Nanoémulsion Tripeptide-stabilisé de l’acide oléique

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59034
, , , ,
1Department of Chemistry,Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women’s Health Research Institute,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research,Western Connecticut Health Network

Summary

Ce protocole décrit une méthode efficace pour synthétiser une nanoémulsion d’un conjugué de la teneur en acide oléique acids-platinum(II) stabilisé avec un tripeptide lysine-tyrosine-phénylalanine (KYF). Les formes nanoémulsion dans des conditions douces synthétiques par auto-assemblage de la KYF et le conjugué.

Abstract

Les auteurs décrivent une méthode pour produire une nanoémulsion composée d’un noyau de acids-Pt(II) en acide oléique et d’un revêtement (KYF) de lysine-tyrosine-phénylalanine (KYF-Pt-NE). La KYF-Pt-NE encapsule pt (ii) à 10 % m/m, a un diamètre de 107 ± 27 nm et une charge négative de la surface. La KYF-Pt-NE est stable dans l’eau et dans le sérum et est biologiquement active. La conjugaison d’un fluorophore à KYF permet la synthèse d’une nanoémulsion fluorescente qui convient pour l’imagerie biologique. La synthèse de la nanoémulsion s’effectue dans un environnement aqueux et les formes de KYF-Pt-NE par auto-assemblage d’un peptide KYF court et un conjugué de acids-platinum(II) en acide oléique. Le processus d’auto-assemblage dépend de la température de la solution, le rapport molaire des substrats et la vitesse d’écoulement de l’addition du substrat. Étapes cruciales incluent maintenant le taux d’agitation optimal pendant la synthèse, permettant un délai suffisant pour l’auto-assemblage et pré concentre la nanoémulsion progressivement dans un concentrateur centrifuge.

Introduction

Ces dernières années, il y a eu un intérêt croissant pour l’ingénierie des nanoparticules pour des applications biomédicales comme medicaments et bioimaging1,2,3,4. La multifonctionnalité des systèmes à base de nanoparticules nécessite souvent incorporant plusieurs composants dans une formulation. Les blocs de construction qui reposent souvent sur des lipides ou des polymères se distinguent par leurs propriétés physico-chimiques ainsi que leur biocompatibilité et biodégradabilité, qui finalement pourrait affecter la fonction de la nanostructure1, 5,6. Des matériaux biologiques, tels que des protéines et des peptides, ont longtemps été reconnus comme éléments prometteurs de nanostructures multifonctionnel en raison de leur séquence flexibilité7,8. Peptides s’auto-assembler en ordonnées architectures supramoléculaires formant hélicoïdale rubans9,10, échafaudages fibreuse11,12et bien d’autres encore, ouvrant ainsi la voie au renforcement des nanostructures hybrides axée sur la biomolécule utilisant un ascendant approche13.

Peptides ont été explorées pour des applications en médecine et en biotechnologie, en particulier pour la thérapie anticancéreuse14 et maladies cardiovasculaires15 aussi bien en ce qui concerne les antibiotiques développement16,17, métabolique troubles18et les infections19. Il y a plus d’une centaine de petit-peptide thérapeutique, l’objet d’essais cliniques20. Les peptides sont faciles à modifier et rapide à synthétiser à petit prix. En outre, ils sont biodégradables, ce qui facilite grandement leur applications biologiques et pharmaceutiques21,22. L’utilisation de peptides comme éléments structuraux comprend l’ingénierie des nanoparticules peptidique, rompus et des dépôts d’hydrogel pour Liberation controlee23,24,25,26 , 27, biocapteurs à base de peptides28,29,30,31ou des dispositifs bio-électroniques32,33,34. Ce qui est important, même petits peptides avec deux ou trois résidus d’acide aminé qui incluent la phénylalanine trouvées pour guider l’auto-assemblage traite35,36,37 et créer des émulsions stabilisées38 .

Médicaments à base de platine, en raison de leur grande efficacité, sont utilisés dans de nombreux régimes de traitement du cancer, aussi bien seul ou en combinaison avec d’autres agents39,40. Composés de platine induisent des lésions de l’ADN en formant des liaisons transversales des monotypes et système ou interstrand. Les lésions de l’ADN-Pt sont reconnues par la machinerie cellulaire et, si ne pas réparés, conduisent à l’apoptose cellulaire. Le plus important mécanisme, par lequel pt (ii) contribue à la mort des cellules cancéreuses, est l’inhibition de l’ADN transcription41,,42. Toutefois, les avantages de la thérapie de platine sont diminués par une toxicité systémique du PT (ii) qui déclenche des effets secondaires graves. Ceci mène à plus faible dosage clinique de PT (ii)43, qui aboutit souvent à des concentrations sous thérapeutiques du platine pour atteindre l’ADN. En conséquence, la réparation de l’ADN qui suit contribue à la survie des cellules du cancer et l’acquisition de résistance pt (ii). La chimio-résistance de platine est un problème majeur dans la thérapie anticancéreuse et la principale cause d’échec de traitement44,45.

Nous avons développé une conception stable qui encapsule l’agent pt (ii) afin de fournir un effet protecteur dans la circulation systémique et pour diminuer les effets secondaires induits par Pt II. Le système est basé sur un noyau de acids-Pt(II) en acide oléique stabilisé avec un tripeptide KYF pour former une nanoémulsion (KYF-Pt-NE)46. Les éléments constitutifs de la KYF-Pt-NE, les acides aminés de tripeptide ainsi que l’acide oléique, ont le statut de Generally Recognized As Safe (GRAS) avec la Food and Drug Administration (FDA). La KYF-Pt-N’est préparé à l’aide d’une méthode de nanoprécipitation47. En bref, le conjugué de acids-Pt(II) en acide oléique est dissous dans un solvant organique et ensuite ajouté goutte à goutte d’une solution aqueuse de KYF (Figure 1) à 37 ° C. La solution est agitée pendant plusieurs heures pour permettre à l’auto-assemblage de la la KYF-Pt-NE. La nanoémulsion est concentrée dans 10 kDa centrifuge concentrateurs et laver trois fois avec de l’eau. La modification chimique de la KYF avec un fluorophore permet la synthèse de fluorescent FITC-KYF-Pt-NE convient d’imagerie biomédicale.

Protocol

1. synthèse de la teneur en acide oléique Acids–Platinum(II) conjugué Activation du cisplatine Suspendre 50 mg (0,167 mmol) de cisplatine dans 4 mL d’eau (p. ex., nanopure) à 60 ° C. Ajouter goutte à goutte 55,2 mg (0.325 mmol) de AgNO3 dans 0,5 mL d’eau à la solution de cisplatine et de remuer la réaction pendant au moins 2 h à 60 ° C. Le précipité blanc de AgCl formera indiquant l’état d’avancement de la réaction. Pour déterminer si la réactio…

Representative Results

Image représentant TEM KYF-Pt-ne préparé à l’aide de ce protocole est montré dans la Figure 2 a. La KYF-Pt-NEs sont sphériques en morphologie, bien dispersée et de taille uniforme. Le diamètre du noyau de la KYF-Pt-NEs, mesurés directement à partir de trois images TEM avec un minimum de 200 mesures fait, est de 107 ± 27 nm. Le diamètre hydrodynamique des KYF-Pt-NE, analysée par spectroscopie lumineuse dynamique (DLS), s’est avéré pour être…

Discussion

Des étapes cruciales dans la synthèse de nanoémulsion incluent le rapport molaire des substrats de réglage, maintenir contrôle température et le débit de la fréquence pendant l’ajout de acids–Pt(II) en acide oléique, fournissant suffisamment de temps pour l’auto-assemblage et purifier le produit à l’aide une colonne de concentrateur centrifuge. Ces paramètres influent sur la taille et la morphologie de la KYF-Pt-NE ; ainsi, il est particulièrement important maintenir le bon rapport molaire et ajuster…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous reconnaissons l’appui financier de l’Institut National du Cancer, grant SC2CA206194. Aucun intérêts financiers concurrents ne sont déclarés.

Materials

2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring
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Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).
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