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Bioengineering

Uma Nanoemulsão estabilizada tripeptídeo de ácido oleico

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59034
, , , ,
1Department of Chemistry,Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women’s Health Research Institute,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research,Western Connecticut Health Network

Summary

Este protocolo descreve um método eficiente para sintetizar uma Nanoemulsão de um conjugado de oleico acids-platinum(II) estabilizado com um tripéptido fenilalanina-lisina-tirosina (KYF). As formas de Nanoemulsão sob condições sintéticas suaves através de auto-montagem do KYF e o conjugado.

Abstract

Nós descrevemos um método para produzir uma Nanoemulsão composta de um núcleo de acids-Pt(II) oleico e um revestimento (KYF) de fenilalanina-lisina-tirosina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE encapsula Pt(II) a 10% do peso, tem um diâmetro de 107 ± 27 nm e uma carga negativa de superfície. KYF-Pt-NE é estável na água e no soro e é biologicamente ativo. A conjugação de um fluoróforo para KYF permite a síntese de uma Nanoemulsão fluorescente que é apropriado para a imagem latente biológica. A síntese da Nanoemulsão é executada em um ambiente aquoso e as formas de KYF-Pt-NE através de auto-montagem de um peptídeo KYF curto e um conjugado acids-platinum(II) oleico. A auto-montagem processo depende da temperatura da solução, a razão molar entre os substratos e a taxa de fluxo da adição de substrato. Etapas cruciais incluem mantendo a taxa ideal de agita durante a síntese, permitindo tempo suficiente para self-assembly e pre-concentrando a Nanoemulsão gradualmente em um concentrador centrífugo.

Introduction

Nos últimos anos, tem havido um interesse crescente na engenharia de nanopartículas para tais aplicações biomédicas, como a entrega da droga e bioimaging1,2,3,4. A multifuncionalidade dos sistemas baseados em nanopartículas necessita frequentemente incorporando vários componentes dentro de uma formulação. Os blocos de construção que são baseados em lipídios ou polímeros muitas vezes diferem em termos de suas propriedades físico-químicas, bem como sua biocompatibilidade e biodegradabilidade, que em última análise, pode afetar a função do nanostructure1, 5,6. Biologicamente derivada de materiais, tais como proteínas e peptídeos, há muito foram reconhecidos como promissoras componentes de nanoestruturas multifuncionais devido à sua flexibilidade de sequência7,8. Peptídeos auto-montagem em arquiteturas supramoleculares altamente ordenadas, formando helicoidal fitas9,10, andaimes fibroso11,12e muitos mais, abrindo assim o caminho para a construção -híbrida biomolécula nanoestruturas usando um ascendente abordagem13.

Peptídeos têm sido explorados para aplicações em medicina e biotecnologia, especialmente para a terapia anticâncer14 e doenças cardiovasculares15 , bem como para desenvolvimento de antibióticos16,17, metabólica distúrbios de18e infecções19. Há mais de uma centena de pequenas-peptídeo terapêutica submetidos a ensaios clínicos20. Peptídeos são fáceis de modificar e rápido para sintetizar a baixo custo. Além disso, eles são biodegradáveis, que facilita muito suas aplicações biológicas e farmacêuticas21,22. O uso de peptídeos como componentes estruturais inclui a engenharia de nanopartículas responsivos, baseado em peptídeo e depósitos de hidrogel para liberação controlada23,24,25,26 , 27, baseado em peptídeo biosensores28,29,30,31ou dispositivos bio-elétrica32,33,34. Importante, nem curtos peptídeos com dois ou três resíduos de aminoácidos que incluem fenilalanina foram encontrados para guiar a auto-montagem processa35,36,37 e criar emulsões estabilizadas38 .

Drogas baseada em platina, devido a sua alta eficácia, são usadas em muitos esquemas de tratamento de câncer, tanto sozinho como em combinação com outros agentes39,40. Compostos de platina induzem danos ao DNA, formando ligações cruzadas de monoadducts e intrastrand ou interstrand. As lesões do ADN-Pt são reconhecidas pela maquinaria celular e, se não reparado, levam a apoptose celular. O mecanismo mais importante, pelo qual Pt(II) contribui para a morte de células de câncer, é a inibição da transcrição de DNA41,42. No entanto, os benefícios da terapia de platina são diminuídos pela toxicidade sistêmica de Pt(II) que provoca efeitos colaterais graves. Isto leva a baixa dosagem clínica de Pt(II)43, que muitas vezes resulta em concentrações subterapêuticas de platina, atingindo o DNA. Como consequência, a reparação do DNA que segue contribui para a sobrevivência de células de câncer e adquirir resistência Pt(II). A quimioterapia-resistência de platina é um grande problema na terapia anticâncer e a principal causa de falha de tratamento44,45.

Nós desenvolvemos um nanosystem estável que encapsula o agente Pt(II) a fim de proporcionar um efeito de blindagem na circulação sistêmica e para diminuir os efeitos colaterais Pt II-induzida. O sistema é baseado em um núcleo de oleico acids-Pt(II) estabilizado com um tripéptido KYF para formar uma Nanoemulsão (KYF-Pt-NE)46. Os blocos de construção de KYF-Pt-NE, os aminoácidos do tripeptídeo, bem como o ácido oleico, têm o estatuto de geralmente reconhecidos como seguros (GRAS) com a Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE é preparada usando um método de nanoprecipitation47. Em suma, o conjugado acids-Pt(II) oleico é dissolvido em um solvente orgânico e em seguida adicionado gota a gota à solução aquosa KYF (Figura 1) a 37 ° C. A solução é agitada por várias horas permitir a auto-montagem do KYF-Pt-ne A Nanoemulsão está concentrada em 10 kDa de concentradores centrífugos e lavada três vezes com água. A modificação química do KYF com um fluoróforo permite a síntese de fluorescente FITC-KYF-Pt-NE apropriado para a imagem latente biomedical.

Protocol

1. síntese do conjugado Acids–Platinum(II) oleico Ativação da Cisplatina Suspender a 50 mg (0.167 mmol) de cisplatina em 4 mL de água (por exemplo, nanopure) a 60 ° C. Adicionar gota a gota-mg 55,2 (0.325 mmol) de AgNO3 em 0,5 mL de água para a solução da cisplatina e mexa a reação pelo menos 2 h a 60 ° C. O precipitado branco de AgCl formarão indicando o progresso da reação. Para determinar se a reação de ativação é concluída, realize o teste com 1…

Representative Results

Imagem de representante TEM de KYF-Pt-NE preparada usando este protocolo é mostrada na Figura 2A. KYF-Pt-NEs são esféricos na morfologia, bem dispersa e uniforme no tamanho. O diâmetro do núcleo da KYF-Pt-NEs, medido diretamente a partir de três imagens de temperatura com um mínimo de 200 medições feito, é 107 ± 27 nm. O diâmetro hidrodinâmico de KYF-Pt-NE, analisado usando espectroscopia de luz dinâmica (DLS), foi encontrado para ser 240 nm, co…

Discussion

Passos críticos na síntese Nanoemulsão incluem ajustando a relação molar entre os substratos, mantendo controle de taxa de fluxo e temperatura durante a adição de acids–Pt(II) oleico, proporcionando tempo suficiente para auto-montagem e purificar o produto usando um coluna de concentrador centrífugo. Estes parâmetros influenciam o tamanho e morfologia de KYF-Pt-NE; assim, é particularmente importante manter a relação molar adequada e ajustar as condições sintéticas corretamente.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconhecemos, com gratidão, apoio financeiro do Instituto Nacional de câncer, conceda SC2CA206194. Sem interesses financeiros concorrentes são declarados.

Materials

2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring
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Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).
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