In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren
Summary
Protein-Protein-Interaktionen sind von entscheidender Bedeutung für biologische Systeme, und Studien der verbindliche Kinetik geben Einblicke in die Dynamik und Funktion von Proteinkomplexen. Wir beschreiben eine Methode, die die kinetischen Parameter von einem Proteinkomplex mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer und die gestoppt-Flow-Technik quantifiziert.
Abstract
Proteine sind die primären Betreiber von biologischen Systemen, und sie in der Regel interagieren mit anderen Makro oder kleine Moleküle, deren biologische Funktionen durchzuführen. Solche Interaktionen können sehr dynamisch, d. h. die interagierenden Untereinheiten sind ständig verbunden und getrennt zu bestimmten Preisen sein. Während Messen der Bindungsaffinität mit Techniken wie quantitative Pulldown-Menü zeigt die Stärke der Wechselwirkung, studieren die verbindliche Kinetik Einblicke darüber, wie schnell gibt die Interaktion erfolgt und wie lange jede Anlage bestehen kann. Darüber hinaus messen die Kinetik einer Interaktion in der Gegenwart ein zusätzlicher Faktor, wie ein Protein-Austausch-Faktor oder ein Medikament hilft den Mechanismus zu offenbaren, die Interaktion durch den anderen Faktor geregelt ist, wichtige Erkenntnisse für die Bereitstellung, der Förderung der biologischen und medizinischen Forschung. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der verbindliche Kinetics von einem Proteinkomplex, das hat eine hohe intrinsische Verband und kann schnell durch ein anderes Protein getrennt werden. Die Methode verwendet Fluoreszenz Resonanz Energietransfer um zu melden, die Bildung von in-vitro-Protein-Komplex, und es ermöglicht die Überwachung der schnelle Assoziation und Dissoziation des Komplexes in Echtzeit auf einem gestoppt-Flow Fluorimeter. Mit diesem Test, werden die Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten von dem Proteinkomplex quantifiziert.
Introduction
Biologische Aktivitäten erfolgt letztlich durch Proteine, die meisten davon mit anderen für richtige biologische Funktionen interagieren. Mit einem rechnerischen Ansatz, der Gesamtbetrag der Protein-Protein-Interaktionen in der menschlichen wird voraussichtlich 650.000 ~1und Störung dieser Interaktionen oft führt zu Krankheiten2. Durch ihre entscheidende Rolle bei der Kontrolle der zellulärer und organismal Prozessen wurden zahlreiche Methoden entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie Hefe-zwei-Hybrid, bimolekulare Fluoreszenz Komplementierung, Split-Luciferase studieren Ergänzung und co-Immunopräzipitation Assay3. Während diese Methoden gut entdecken und Bestätigung von Protein-Protein-Interaktionen sind, sie sind in der Regel nicht-quantitative und somit bieten nur begrenzte Informationen über die Affinität zwischen den Interaktionspartnern Protein. Quantitative Pulldown-Menüs können zur Messung der Bindungsaffinität (z. B. die Dissoziationskonstante Kd), aber es misst nicht die Kinetik der Bindung, noch kann es angewendet werden, wenn die K-d sehr niedrig, da eine unzureichende ist Signal-Rausch-Verhältnis4. Surface Plasmon-Resonanz (SPR)-Spektroskopie quantifiziert die verbindliche Kinetik, aber es erfordert eine spezifische Oberfläche und Immobilisierung von einem Reaktionspartner auf der Oberfläche, die potenziell die Binding-Eigenschaft der Reaktanten5ändern können. Darüber hinaus ist es schwierig für SPR schnell Assoziation und Dissoziation Preise5messen, und es ist nicht angebracht, SPR verwenden, um die Charakterisierung der Veranstaltung zum Austausch von Protein-Untereinheiten in einem Proteinkomplex. Hier beschreiben wir eine Methode, die erlaubt Messraten von Protein komplexe Montage und Demontage auf einer Millisekunde Zeitskala. Diese Methode war wesentlich für die Bestimmung der Rolle von CUllin – Warnformate –Nedd8 –dIssociated Protein 1 (Cand1)als die F-Box Protein Austausch Faktor6,7.
Cand1 regelt die Dynamik der Skp1•Cul1•F-Box-Protein (SCF) E3 Ligases, die zu der großen Familie von Cullin-RING Ubiquitin Ligases gehören. SKSF bestehen aus den cullin, Cul1, die das RING Domain Protein Rbx1 bindet, und eine austauschbare F-Box Protein, das Rekruten Substrate und Cul1 durch den Adapter Protein Skp18bindet. Als eine E3-Ligase SCF katalysiert die Konjugation des Ubiquitin an seinem Substrat, und es ist aktiviert, wenn das Substrat durch die F-Box Protein rekrutiert und Cul1 des Proteins Ubiquitin-artigen Nedd89geändert wird. Cand1 bindet unmodifizierten Cul1 und bei der Bindung, stört es sowohl der Verband der Skp1•F-Box-Protein mit Cul1 und die Konjugation von Nedd8 bis Cul110,11,12,13. Infolgedessen Cand1 schien ein Inhibitor der SCF Aktivität in vitro, aber Cand1 Mangel in Organismen verursacht Mängel, die eine positive Rolle des Cand1 schlägt bei der Regulierung der SCF Aktivitäten in Vivo14,15,16 , 17. dieses Paradox erklärt sich schließlich durch eine quantitative Studie, die die dynamische Interaktionen zwischen Cul1, Cand1 und Skp1•F-Box-Protein enthüllt. Mit Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Assays, die die Bildung der SCF und Cul1•Cand1 komplexe erkennen, der Assoziation und Dissoziation bewerten konstanten (kauf und kab, beziehungsweise) wurden einzeln gemessen. Die Messungen ergaben, dass Cand1 und Skp1•F-Box Protein Form extrem engen Komplex mit Cul1, aber die kaus der SCF durch Cand1 drastisch erhöht wird und die kaus der Cul1•Cand1 wird drastisch erhöht Skp1•F-Box Protein6,7. Diese Ergebnisse unterstützen die aus- und kritische Bestimmung der Rolle der Cand1 als ein Protein Austausch Faktor, der die Bildung von neuen SCF-komplexe durch recycling von Cul1 aus der alten SCF komplexe katalysiert.
Hier präsentieren wir Ihnen das Verfahren der Entwicklung und Verwendung der Bund-Assay, um die Dynamik der Cul1•Cand1 Komplex7zu studieren, und das gleiche Prinzip kann angewendet werden, um die Dynamik der verschiedenen Biomolekülen zu studieren. Bund tritt auf, wenn ein Spender freut sich mit der entsprechenden Wellenlänge, und ein Akzeptor mit Anregungsspektrums Überlappung der Spender Emissionsspektrum in einer Entfernung von 10-100 ist Å. Die angeregten Zustand wird in den Akzeptor, wodurch abnehmender Spender Intensität und Akzeptor Intensität18übertragen. Die Effizienz der Bund (E) hängt der Förster-Radius (R0) und der Abstand zwischen Donor und Akzeptor Fluorophore (R) und zeichnet sich durch: E = R06/ (R0 6 + R6). Der Förster-Radius (R0) hängt von einigen Faktoren, einschließlich der Dipol Winkelorientierung, die spektrale Überlappung der Donor-Akzeptor-paar und die Lösung verwendet,19. Um die Bund-Assay auf einem Fluorimeter gestoppt-Flow anwenden, die die Änderung der Spender Emission in Echtzeit überwacht und ermöglicht Messungen der schnelle kauf und kaus, ist es notwendig, effiziente Bund, Ergebnisse einer signifikanten Reduktion der Spender Emission. Daher gestalten effiziente Bund durch die Wahl der entsprechenden paar fluoreszierende Farbstoffe und Websites auf die Zielproteine um die Farbstoffe zu befestigen ist wichtig und in diesem Protokoll diskutiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
FRET ist ein physikalisches Phänomen, das von großem Interesse für Studium und das Verständnis biologischer Systeme19ist. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Prüfung und Verwendung von Bund, um die verbindliche Kinetik der zwei interagierenden Proteine zu studieren. Beim Bund zu entwerfen, wir hielten drei Hauptfaktoren: die spektrale Überlappung zwischen Emission und Akzeptor Erregung Spender, der Abstand zwischen den zwei Fluorophore und die Dipol-Ausrichtung der Fluorophor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Shu-Ou Shan (California Institute of Technology) für aufschlussreiche Diskussion über die Entwicklung des Bund-Assays. M.G., Y.Z und X.L. wurden durch Start-Fonds von der Purdue University, Y.Z finanziert und X.L.This Arbeit wurde teilweise durch einen Zuschuss der Samen von Purdue University Center für Pflanzenbiologie unterstützt.
Materials
| Anion exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505301 | HiTrap Q FF anion exchange chromatography column |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | 2231000511 | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | ThermoFisher Scientific | C600003 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C78-500 | |
| Cation exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505401 | HiTrap SP Sepharose FF |
| Desalting Column | GE Healthcare | 17085101 | |
| Floor model centrifuge (high speed) | Beckman Coulter | J2-MC | |
| Floor model centrifuge (low speed) | Beckman Coulter | J6-MI | |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html | |
| FluoroMax fluorimeter | HORIBA | FluoroMax-3 | |
| FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| GGGGAMC peptide | New England Peptide | custom synthesis | |
| Glutathione beads | GE Healthcare | 17075605 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Fisher Scientific | 15-529-019 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Ovalbumin | MilliporeSigma | A2512 | |
| pGEX-4T-2 vector | GE Healthcare | 28954550 | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | 4693132001 | |
| Reduced glutathione | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Refrigerated shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Rosetta Competent Cells | MilliporeSigma | 70953-3 | |
| Size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 28990944 | Superdex 200 10/300 GL column |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Stopped-flow fluorimeter | Hi-Tech Scientific | SF-61 DX2 | |
| TCEP·HCl | Fisher Scientific | PI20490 | |
| Thrombin | MilliporeSigma | T4648 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Ultrafiltration membrane | MilliporeSigma | UFC903008 | Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL |
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