ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用
Summary
蛋白質蛋白質の相互作用、生物学的システムにとって重要と拘束運動の研究は、ダイナミクスとタンパク質複合体の機能に対する洞察を提供します。蛋白質の蛍光共鳴エネルギー移動ストップト フロー法を適用した複合体の速度論的パラメーターを定量化する手法について述べる。
Abstract
タンパク質は生物学的システムの主な演算子と通常他のマクロ – または彼らの生物学的機能を遂行する小分子とやり取りします。このような相互作用は、非常にダイナミックな相互作用の亜単位は常に関連付けられているし、特定のレートで解離を意味することができます。高速方法に洞察力を提供定量的プルダウン バインディング機構研究、相互作用の強さを明らかにするようなテクニックを使用する結合親和性を測定しながら相互作用が発生し、それぞれの複合体が存在することができますどのくらい。さらに、相互作用の重要な知識を提供する他の因子によって調節されているメカニズムを明らかにするのに役立ちます蛋白質交換因子、薬物など、その他の要因の存在下での相互作用の動力学を測定、医学生物学の進歩。ここでは、高い組み込み協会率を持ち、別の蛋白質によってすぐに解離することができます蛋白質の複合体の結合動態を測定するためのプロトコルについて述べる。メソッドでは、蛍光共鳴エネルギー移動を使用して、in vitro タンパク質複合体の形成を報告でき高速協会・ ストップト フロー蛍光上でリアルタイムに複合体の解離を監視できます。この試金を使用して、複雑なタンパク質の協会と解離速度定数は定量化しました。
Introduction
生物活性最終的に最もうちで適切な生物学的機能の他のユーザーと対話する蛋白質によって実行されます。計算論的アプローチを使用して、650,000 〜1、人間蛋白質蛋白質の相互作用の総量を推定し、病2につながる多くの場合これらの相互作用の中断。酵母 2 ハイブリッド、分子蛍光補完、分割ルシフェラーゼなどのタンパク質間の相互作用を研究する細胞と個体のプロセスを制御するに重要な役割のための多数の方法を開発されています。補完、および co 免疫沈降分析3。これらのメソッドが検出および蛋白質蛋白質の相互作用を確認するのに優れている、彼らは通常定量的なしたがって、相互作用タンパク質の親和性について限られた情報を提供します。定量的プルダウン ・ リストを使用して、結合親和性 (例えば、解離定数Kd) を測定できますが、バインディングのキネティクスはからずも、それKdが不十分のため非常に低い場合に適用されます。信号対雑音比の4。表面プラズモン共鳴 (SPR) 法による拘束運動を定量化が比表面積、表面、反応5のバインドのプロパティを変えることができる潜在的に 1 つの反応の固定化が必要です。さらに、高速協会と解離率5を測定するための SPR の困難だし、SPR を使用して蛋白質の複合体の蛋白質の亜単位の交換イベントを特徴付ける適切ではないです。ここでは、蛋白質複雑なアセンブリおよびミリ秒のタイム スケールでの分解の率を測定できるようにする方法をについて説明します。このメソッドは、F 箱蛋白質交換要因6,7としてCullin-ssociated –Nedd8 –dissociated 蛋白質1 (Cand1)の役割を決定するために不可欠だった。
Cand1 は、Cullin リング ユビキチンリ ガーゼの大家族に属している Skp1•Cul1•F ボックス蛋白質 (SCF) E3 リガーゼのダイナミクスを調整します。SCFs は、リング ドメイン蛋白質 Rbx1 を結合する Cul1、F ボックス蛋白質が交換可能な基板を募集し、アダプター蛋白質 Skp18を介して Cul1 をバインドのカリンで構成されます。E3 リガーゼとして SCF は、その基板にユビキチンの共役を触媒して基板が F 箱蛋白質によって採用されていると Cul1 がユビキチン様タンパク質 Nedd89によって変更されたときそれがアクティブになります。Cand1 はそのまま Cul1 をバインドし、結合、それが両方の Skp1•F ボックス蛋白質 Cul1 の協会、Cul110、11,12,13Nedd8 活用妨害します。その結果、Cand1 は in vitro での SCF 活動の阻害剤のように見えたが、生物における Cand1 欠乏 vivo14,15,16の SCF の活動を調節する Cand1 の肯定的な役割を示唆している欠陥が発生,17. このパラドックスは最終的に Cul1、Cand1、Skp1•F ボックス蛋白質間の動的相互作用を明らかにする量的な研究によって説明されました。SCF と Cul1•Cand1 複合体の形成を検出蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) 試金を使用して、協会と解離速度定数 (k上とオフk、それぞれ) あった個別に測定します。測定は、Cand1 と Skp1•F ボックス蛋白質フォーム非常にタイトな複雑な Cul1、しかし、 kオフの SCF とは Cand1 で劇的に増加し、 kオフの Cul1•Cand1 が大幅に向上を明らかにしました。Skp1•F ボックス蛋白質6,7。これらの結果は、古い SCF 複合体から Cul1 のリサイクルを通じて新しい SCF 複合体の形成を触媒するタンパク質の交換要因として Cand1 の役割を定義する初期および重要なサポートを提供します。
ここでは、開発と Cul1•Cand1 複雑な7ダイナミクスを研究するフレットの試金を使用しての手順を提案して同じ原理は、様々 な生体分子のダイナミクスを研究に適用できます。フレットは、適切な波長で励起ドナーとドナーの発光スペクトルを重複する励起スペクトルを持つ受容体は 10-100 の範囲内で存在が発生します Å。励起状態は、ドナーの強度を減少させる受容体強度18を増加し、受容体に転送されます。フレット (E) の効率・ フォシュテル半径 (R0) およびドナーとアクセプター フルオロ (r) の間の距離によって異なります、によって定義されます: E = R06/(R06 + r6)。フェルスター半径 (R0) 配向角度を含むいくつかの要因に依存し、ドナー ・ アクセプターのペアとソリューションのスペクトルの重複使用19。リアルタイムでドナーの排出量の変化を監視し、高速でkとkオフの測定が可能、ストップト フロー蛍光にフレット アッセイを適用する効率的なフレットを確立する必要があることドナーの排出量の大幅な削減の結果。したがって、染料を付ける適切な蛍光染料とターゲット蛋白質のサイトのペアを選択することで効率的なフレットの設計は重要であり、このプロトコルで説明。
Protocol
Representative Results
Discussion
フレットは、勉強し、生物学的システム19を理解に非常に役立つは物理現象です。ここでは、テストのフレットを使用して 2 つの相互作用の蛋白質の結合の動力学を調査するためのプロトコルを提案する.フレットをデザインするとき、我々 は 3 つの主要な要因を考慮: ドナーの排出量と受容体の励起、2 つの同時と fluorophores28の双極子の方向間の距離間ス?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
フレットの試金の開発に洞察力に富んだ議論ありがとう集 Ou シャン (カリフォルニア工科大学)。X.L.、Y.Z.、m. g. Y.Z. にパデュー大学からスタートアップ資金によって資金が供給された、X.L.This 作業はパデュー大学センターからのシード補助金によって植物生物学の部分で支えられました。
Materials
| Anion exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505301 | HiTrap Q FF anion exchange chromatography column |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | 2231000511 | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | ThermoFisher Scientific | C600003 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C78-500 | |
| Cation exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505401 | HiTrap SP Sepharose FF |
| Desalting Column | GE Healthcare | 17085101 | |
| Floor model centrifuge (high speed) | Beckman Coulter | J2-MC | |
| Floor model centrifuge (low speed) | Beckman Coulter | J6-MI | |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html | |
| FluoroMax fluorimeter | HORIBA | FluoroMax-3 | |
| FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| GGGGAMC peptide | New England Peptide | custom synthesis | |
| Glutathione beads | GE Healthcare | 17075605 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Fisher Scientific | 15-529-019 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Ovalbumin | MilliporeSigma | A2512 | |
| pGEX-4T-2 vector | GE Healthcare | 28954550 | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | 4693132001 | |
| Reduced glutathione | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Refrigerated shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Rosetta Competent Cells | MilliporeSigma | 70953-3 | |
| Size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 28990944 | Superdex 200 10/300 GL column |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Stopped-flow fluorimeter | Hi-Tech Scientific | SF-61 DX2 | |
| TCEP·HCl | Fisher Scientific | PI20490 | |
| Thrombin | MilliporeSigma | T4648 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Ultrafiltration membrane | MilliporeSigma | UFC903008 | Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL |
References
- Stumpf, M. P. H., et al. Estimating the size of the human interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).
- Kuzmanov, U., Emili, A. Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems. Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).
- Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities. Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).
- Lapetina, S., Gil-Henn, H. A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays. Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).
- Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).
- Pierce, N. W., et al. Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins. Cell. 153 (1), 206-215 (2013).
- Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression. Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).
- Zheng, N., et al. Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex. Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).
- Kleiger, G., Deshaies, R. Tag Team Ubiquitin Ligases. Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).
- Zheng, J., et al. CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex. Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).
- Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation. FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).
- Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).
- Goldenberg, S. J., et al. Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases. Cell. 119 (4), 517-528 (2004).
- Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase. Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).
- Feng, S., et al. Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation. the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).
- Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).
- Lo, S. -. C., Hannink, M. CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1. Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).
- Okamoto, K., Sako, Y. Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).
- Hussain, S. A. An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET). arXiv preprint. , (2009).
- Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases. Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).
- Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. Sortagging: A versatile method for protein labeling. Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).
- Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation. Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates. Cell. 139 (5), 957-968 (2009).
- Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).
- Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins. Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).
- Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
- Lin, C. T., Rorabacher, D. B. Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell. Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).
- Toseland, C. P., Geeves, M. A. Rapid Reaction Kinetic Techniques. Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Lin, C. W., Ting, A. Y. Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells. Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).
- Yin, J., et al. Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).
- Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Development, Growth & Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).
- Kilic, S., et al. Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting. Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).
- Bajar, B. T., et al. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).
