Utilizzo In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer per studiare la dinamica dei complessi della proteina ad una scala di tempo di millisecondo
Summary
Interazioni proteina-proteina sono critiche per sistemi biologici, e studi di cinetica di legame forniscono intuizioni la dinamica e la funzione dei complessi della proteina. Descriviamo un metodo che quantifica i parametri cinetici di una proteina complessa che utilizza il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza e la tecnica di flusso interrotto.
Abstract
Le proteine sono i principali operatori dei sistemi biologici, e di solito interagiscono con altri macro – o piccole molecole per svolgere le loro funzioni biologiche. Tali interazioni possono essere altamente dinamiche, significato le subunità interagenti sono costantemente associate e dissociate a determinate tariffe. Mentre l’affinità di legame utilizzando tecniche quali discesa quantitativa rivela la forza dell’interazione, studiare la cinetica di legame di misurazione fornisce intuizioni su come veloce si verifica l’interazione e per quanto tempo ogni complesso può esistere. Inoltre, la cinetica di un’interazione in presenza di un fattore supplementare, ad esempio un fattore di scambio di proteina o un farmaco, di misura aiuta a rivelare il meccanismo mediante il quale l’interazione è regolata da un altro fattore, fornendo conoscenze importanti per la avanzamento della ricerca biologica e medica. Qui, descriviamo un protocollo per la misurazione la cinetica di legame di un complesso proteico che ha un tasso di alta associazione intrinseco e possa essere dissociato rapidamente da un’altra proteina. Il metodo utilizza il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza per segnalare la formazione del complesso della proteina in vitro, e consente il monitoraggio veloce associazione e dissociazione del complesso in tempo reale su un fluorimetro flusso interrotto. Usando questa analisi, le costanti di velocità di associazione e dissociazione del complesso proteico sono quantificate.
Introduction
Attività biologiche sono in ultima analisi, effettuate dalle proteine, più di cui interagire con gli altri per corrette funzioni biologiche. Utilizzando un approccio computazionale, l’importo totale delle interazioni proteina-proteina in essere umano è stimato essere ~ 650.0001e rottura di queste interazioni spesso conduce a malattie2. A causa del loro ruolo essenziale nel controllo dei processi cellulari e organismi, sono stati sviluppati numerosi metodi per lo studio delle interazioni proteina-proteina, quali lievito-due-ibrido, complementazione bimolecolare fluorescenza, Spalato-luciferasi 3analisi di complementazione e co-immunoprecipitazione. Mentre questi metodi sono bravi a scoprire e confermando le interazioni proteina-proteina, sono solitamente non quantitativi e così fornire informazioni limitate sull’affinità tra i partner di proteine interagenti. Quantitativi di pull-down può essere utilizzato per misurare l’affinità di legame (ad esempio, la costante di dissociazione Kd), ma non misura la cinetica dell’associazione, né può essere applicata quando il Kd è molto bassa a causa di un’inadeguata rapporto segnale-rumore4. Surface plasmon resonance (SPR) spettroscopia quantifica la cinetica di legame, ma richiede una superficie specifica e l’immobilizzazione di un reattivo sulla superficie, che potenzialmente può modificare la proprietà di associazione del reagente5. Inoltre, è difficile per SPR misurare veloce associazione e dissociazione tariffe5, e non è opportuno utilizzare SPR per caratterizzare l’evento di scambio delle unità secondarie della proteina in un complesso proteico. Qui, descriviamo un metodo che permette di misurare il tasso di proteine complesse montaggio e smontaggio in una scala di tempo di millisecondo. Questo metodo è essenziale per determinare il ruolo di Cullin –unesso –Nedd8 –dissociated della proteina 1 (Cand1) come il F-box protein cambio fattore6,7.
Cand1 regola la dinamica della ligasi E3 di Skp1•Cul1•F-casella proteina (SCF), che appartengono alla grande famiglia della ligasi di ubiquitin Cullin-anello. SCFs sono costituiti il cullin Cul1, che lega la proteina di dominio anello Rbx1, e una proteina F-box intercambiabile, che recluta substrati e lega Cul1 attraverso la proteina dell’adattatore Skp18. Come una E3 ligasi, SCF catalizza la coniugazione dell’ubiquitina al suo substrato ed è attivato quando il substrato è reclutato dalla proteina F-box, e quando Cul1 viene modificato dalla proteina ubiquitina-come Nedd89. Cand1 associa Cul1 non modificato e legandosi, disturba sia l’associazione di proteine Skp1•F-box con Cul1 e la coniugazione di Nedd8 a Cul110,11,12,13. Di conseguenza, Cand1 è sembrato essere un inibitore di attività SCF in vitro, ma Cand1 carenza negli organismi ha causato i difetti che suggerisce un ruolo positivo di Cand1 nel regolare l’attività SCF in vivo14,15,16 , 17. questo paradosso infine è stato spiegato da uno studio quantitativo che ha rivelato le interazioni dinamiche tra proteine Cul1, Cand1 e Skp1•F-box. Usando le fluorescenza risonanza energy transfer (FRET) analisi che rilevano la formazione dei complessi SCF e Cul1•Cand1, l’associazione e dissociazione rate costanti (ksu e koff, rispettivamente) sono stati misurato singolarmente. Le misurazioni hanno rivelato che sia Cand1 e Skp1•F-box forma estremamente stretta complesso proteico con Cul1, ma la kfuori di SCF è aumentata drammaticamente di Cand1 e la kfuori del Cul1•Cand1 è aumentato drammaticamente da Skp1•F-casella proteina6,7. Questi risultati forniscono il supporto iniziale e fondamentale per definire il ruolo di Cand1 come un fattore di scambio di proteina, che catalizza la formazione di nuovi complessi SCF attraverso il riciclo Cul1 dai vecchi complessi SCF.
Qui, presentiamo la procedura di sviluppare e utilizzare il tasto test per studiare la dinamica del complesso Cul1•Cand17, e lo stesso principio può essere applicato per lo studio della dinamica delle varie biomolecole. FRET si verifica quando un donatore è eccitato con la lunghezza d’onda appropriata, e un accettore con spettro di eccitazione sovrapposizione lo spettro di emissione del donatore è presente all’interno di una distanza di 10-100 Å. Lo stato eccitato viene trasferito al ricettore, quindi diminuendo l’intensità di donatore e aumentando l’ intensità di accettore18. L’efficienza della FRET (E) dipende dalla funzione del raggio di Förster (R0) e la distanza tra il donatore e accettore fluorofori (r) ed è definito da: E = R06/ (R0 6 + r6). Il raggio di Förster (R0) dipende da alcuni fattori, tra cui l’orientamento angolare di dipolo, la sovrapposizione spettrale della coppia donatore-accettore e la soluzione usata19. Per applicare l’analisi FRET su un fluorimetro flusso interrotto, che rileva la variazione dell’emissione dei donatori in tempo reale e permette di eseguire misure di veloce ksu e kfuori, è necessario stabilire FRET efficiente che Risultati in una significativa riduzione dell’emissione di donatore. Di conseguenza, progettazione efficiente FRET scegliendo la coppia appropriata di coloranti fluorescenti e siti su proteine bersaglio per fissare i coloranti è importante e sarà discusso in questo protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
FRET è un fenomeno fisico che è di grande interesse per lo studio e la comprensione di sistemi biologici19. Qui, presentiamo un protocollo per il testing e usando FRET per studiare la cinetica di legame di due proteine interagenti. Quando si progetta FRET, abbiamo considerato tre fattori principali: la sovrapposizione spettrale tra donatore di emissione e accettore di eccitazione, la distanza tra i due fluorofori e l’orientamento del dipolo dei fluorofori28. Per scegliere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Shu-Ou Shan (California Institute of Technology) per penetranti discussione sullo sviluppo del dosaggio FRET. M.G., Y.Z. e X.L. sono stati finanziati dai fondi di avvio dalla Purdue University a Y.Z. e X.L.This lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione di seme da Purdue University Center per biologia vegetale.
Materials
| Anion exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505301 | HiTrap Q FF anion exchange chromatography column |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | 2231000511 | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | ThermoFisher Scientific | C600003 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C78-500 | |
| Cation exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505401 | HiTrap SP Sepharose FF |
| Desalting Column | GE Healthcare | 17085101 | |
| Floor model centrifuge (high speed) | Beckman Coulter | J2-MC | |
| Floor model centrifuge (low speed) | Beckman Coulter | J6-MI | |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html | |
| FluoroMax fluorimeter | HORIBA | FluoroMax-3 | |
| FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| GGGGAMC peptide | New England Peptide | custom synthesis | |
| Glutathione beads | GE Healthcare | 17075605 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Fisher Scientific | 15-529-019 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Ovalbumin | MilliporeSigma | A2512 | |
| pGEX-4T-2 vector | GE Healthcare | 28954550 | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | 4693132001 | |
| Reduced glutathione | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Refrigerated shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Rosetta Competent Cells | MilliporeSigma | 70953-3 | |
| Size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 28990944 | Superdex 200 10/300 GL column |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Stopped-flow fluorimeter | Hi-Tech Scientific | SF-61 DX2 | |
| TCEP·HCl | Fisher Scientific | PI20490 | |
| Thrombin | MilliporeSigma | T4648 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Ultrafiltration membrane | MilliporeSigma | UFC903008 | Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL |
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