Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду
Summary
Белок белковых взаимодействий являются критическими для биологических систем, и исследования кинетики привязки обеспечивают понимание динамики и функции белковых комплексов. Мы описываем метод, который дает количественную оценку кинетических параметров белкового комплекса, с помощью передачи энергии резонансной флюоресценции и остановить поток техники.
Abstract
Белки являются основным операторам биологических систем, и они обычно взаимодействуют с другими макро – или малых молекул выполнять свои биологические функции. Такое взаимодействие может быть высокодинамичный, означает взаимодействующих подразделений постоянно связаны и отделить некоторые ставкам. В то время как измерения сродство с использованием методов, таких как количественные выпадающем показывает силу взаимодействия, изучение кинетики привязки предоставляет информацию о том, как быстро происходит взаимодействие и как долго каждый комплекс может существовать. Кроме того, измерения кинетика взаимодействия присутствии дополнительным фактором, как фактор обмена белков или наркотиков, помогает раскрыть механизм, по которому взаимодействие регулируется другим фактором, предоставляя важные знания для улучшения биологических и медицинских исследований. Здесь мы описываем протокол для измерения кинетики привязки комплекс белков, который имеет высокое внутренне присущей ей связи скорость и может быть отделен быстро по другим белком. Этот метод использует передачи энергии резонансная флюоресценция сообщить формирования комплекса белков в пробирке, и позволяет мониторинга быстро ассоциации и диссоциация комплекса в режиме реального времени на fluorimeter остановить поток. Используя этот assay, количественно ассоциации и диссоциации константы скорости комплекс белков.
Introduction
В конечном счете биологическая деятельность осуществляется белков, Последнее из которых взаимодействовать с другими для надлежащего биологических функций. Используя вычислительный подход, общее количество белок белковых взаимодействий в человека оценивается в1~ 650 000, и нарушения этих взаимодействий часто приводит к заболеваниям2. Из-за их существенно важную роль в контроле процессов клеточной и научные многочисленные методы были разработаны для изучения взаимодействия протеин протеина, такие как дрожжи 2 гибрида, bimolecular флуоресценции комплементарности, Сплит Люцифераза дополнения и co иммунопреципитация пробирного3. Хотя эти методы являются хорошими на открытие и подтверждение белок белковых взаимодействий, они обычно неколичественного и таким образом предоставляют ограниченную информацию о сходство между взаимодействия партнеров белка. Количественные тянуть Даунс может использоваться для измерения сродство (например, Константа диссоциации Kd), но он не измерить кинетика привязки не могут быть применены, когда Kd очень низка из-за неадекватной Соотношение сигнал шум4. Спектроскопия резонанса (СРП) поверхностного плазмон количественно кинетики привязки, но она требует удельной поверхности и иммобилизация одной реагент на поверхности, которые потенциально могут изменить свойство привязки реагент5. Кроме того это трудно для СРП для измерения быстро ассоциации и диссоциации ставки5, и это не целесообразно использовать СРП для характеризуют событие обмена субблоков протеина в комплекс белков. Здесь мы описываем метод, который позволяет измерения количества белка сложные сборки и разборки в масштабе времени миллисекунду. Этот метод имеет важное значение для определения роли Cullin –ssociated –Nedd8 –дissociated белок 1 (Cand1) как F-box белка обмен фактор6,7.
Cand1 регулирует динамика Skp1•Cul1•F-бокс белка (SCF) E3 ligases, которые принадлежат к большой семье Каллин-кольцо убиквитин ligases. Заявок состоят из Каллин Cul1, который связывает кольцо домен белка Rbx1, и взаимозаменяемыми F-box белка, который вербует субстратов и связывает Cul1 через адаптер белок СКП18. Лигаза E3 SCF катализирует спряжение убиквитин к его основанию, а он активируется, когда субстрат завербован F-box белка, и когда Cul1 изменяется убиквитин подобных белков Nedd89. Cand1 связывает неизмененном Cul1, и после привязки, она разрушает как ассоциации белка Skp1•F-бокс с Cul1 и спряжение Nedd8 Cul110,11,12,13. В результате Cand1, по-видимому, ингибитор SCF активности в пробирке, но Cand1 дефицита в организмах причиной дефектов, которые предполагает позитивную роль Cand1 в регулировании деятельности компаний СКФ в vivo14,,1516 , 17. Этот парадокс объясняется наконец количественного исследования, которые показали динамического взаимодействия между Cul1, Cand1 и Skp1•F-бокс белка. С помощью флуоресценции резонанс энергии передачи (ЛАДА) анализов, которые обнаруживают формирования СКФ и Cul1•Cand1 комплексов, ассоциации и диссоциации оценить константы (kна и kот, соответственно) были измеряется в отдельности. Измерения показали, что Cand1 и Skp1•F-бокс белка форме крайне сжатые комплекс с Cul1, но kот SCF резко увеличивается на Cand1 и kот Cul1•Cand1 резко увеличилось Skp1•F-бокс белок6,7. Эти результаты обеспечивают поддержку первоначальных и критических для определения роли Cand1 как фактор обмена белков, который катализирует образование комплексов новых SCF путем переработки Cul1 от старых СКФ комплексами.
Здесь мы представляем процедура разработки и использования ладу assay для изучения динамики Cul1•Cand1 комплекс7, и тот же принцип может применяться для изучения динамики различных биомолекул. ЛАДУ происходит, когда донор возбужденных с соответствующей длины волны, и акцептора с перекрывающихся доноров спектр излучения спектра возбуждения присутствует на расстоянии 10-100 Å. Возбужденное состояние передается акцептор, тем самым уменьшается интенсивность доноров и увеличения интенсивности акцептора18. Эффективность ладу (E) зависит от радиуса Фёрстер (R0) и расстояние между доноров и акцепторов флуорофоров (r) и определяется: E = R06/ (R0 6 + r6). Радиус Фёрстер (R0) зависит от нескольких факторов, включая угловые ориентацию диполя, спектральные совпадения донорно акцепторной пара и решение используется19. Применять assay ладу на остановился потока fluorimeter, который отслеживает изменения выбросов доноров в режиме реального времени и обеспечивает измерение быстро kна и kот, необходимо создать эффективный ладу, приводит к значительному сокращению выбросов доноров. Таким образом проектирование эффективных ладу, выбрав соответствующие пары флуоресцентных красителей и сайтов на целевых белков прикрепить красители имеет важное значение и будут обсуждаться в настоящем Протоколе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Лада-это физическое явление, которое представляет большой интерес для изучения и понимания биологических систем19. Здесь мы представляем собой протокол для тестирования и использования лад для изучения кинетики привязки двух взаимодействующих белков. При проектировании …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Шу-Ou Шань (Калифорнийский технологический институт) за глубокий дискуссии о развитии assay ладу. М.г., ВМФ и X.L. финансировались запуска средств из Университета Пердью в ВМФ и X.L.This работы была частично поддержана семян грант от центра Университета Purdue для биологии растений.
Materials
| Anion exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505301 | HiTrap Q FF anion exchange chromatography column |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | 2231000511 | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | ThermoFisher Scientific | C600003 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C78-500 | |
| Cation exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505401 | HiTrap SP Sepharose FF |
| Desalting Column | GE Healthcare | 17085101 | |
| Floor model centrifuge (high speed) | Beckman Coulter | J2-MC | |
| Floor model centrifuge (low speed) | Beckman Coulter | J6-MI | |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html | |
| FluoroMax fluorimeter | HORIBA | FluoroMax-3 | |
| FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| GGGGAMC peptide | New England Peptide | custom synthesis | |
| Glutathione beads | GE Healthcare | 17075605 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Fisher Scientific | 15-529-019 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Ovalbumin | MilliporeSigma | A2512 | |
| pGEX-4T-2 vector | GE Healthcare | 28954550 | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | 4693132001 | |
| Reduced glutathione | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Refrigerated shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Rosetta Competent Cells | MilliporeSigma | 70953-3 | |
| Size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 28990944 | Superdex 200 10/300 GL column |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Stopped-flow fluorimeter | Hi-Tech Scientific | SF-61 DX2 | |
| TCEP·HCl | Fisher Scientific | PI20490 | |
| Thrombin | MilliporeSigma | T4648 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Ultrafiltration membrane | MilliporeSigma | UFC903008 | Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL |
References
- Stumpf, M. P. H., et al. Estimating the size of the human interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).
- Kuzmanov, U., Emili, A. Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems. Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).
- Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities. Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).
- Lapetina, S., Gil-Henn, H. A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays. Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).
- Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).
- Pierce, N. W., et al. Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins. Cell. 153 (1), 206-215 (2013).
- Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression. Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).
- Zheng, N., et al. Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex. Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).
- Kleiger, G., Deshaies, R. Tag Team Ubiquitin Ligases. Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).
- Zheng, J., et al. CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex. Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).
- Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation. FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).
- Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).
- Goldenberg, S. J., et al. Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases. Cell. 119 (4), 517-528 (2004).
- Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase. Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).
- Feng, S., et al. Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation. the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).
- Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).
- Lo, S. -. C., Hannink, M. CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1. Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).
- Okamoto, K., Sako, Y. Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).
- Hussain, S. A. An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET). arXiv preprint. , (2009).
- Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases. Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).
- Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. Sortagging: A versatile method for protein labeling. Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).
- Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation. Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates. Cell. 139 (5), 957-968 (2009).
- Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).
- Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins. Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).
- Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
- Lin, C. T., Rorabacher, D. B. Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell. Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).
- Toseland, C. P., Geeves, M. A. Rapid Reaction Kinetic Techniques. Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Lin, C. W., Ting, A. Y. Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells. Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).
- Yin, J., et al. Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).
- Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Development, Growth & Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).
- Kilic, S., et al. Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting. Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).
- Bajar, B. T., et al. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).
