एक मिलीसेकंड समय स्केल पर प्रोटीन परिसरों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विट्रो प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण में उपयोग करना
Summary
प्रोटीन प्रोटीन बातचीत जैविक प्रणालियों के लिए महत्वपूर्ण हैं, और बाध्यकारी कैनेटीक्स के अध्ययन गतिशीलता और प्रोटीन परिसरों की कार्यप्रणाली में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । हम एक विधि है कि एक प्रोटीन प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण और बंद प्रवाह तकनीक का उपयोग कर परिसर के गतिज मापदंडों quantifies का वर्णन ।
Abstract
प्रोटीन जैविक प्रणालियों के प्राथमिक ऑपरेटर हैं, और वे आम तौर पर अन्य मैक्रो-या छोटे अणुओं के साथ अपने जैविक कार्यों को पूरा करने के लिए बातचीत करते हैं । इस तरह की बातचीत अत्यधिक गतिशील हो सकती है, जिसका अर्थ है इंटरैक्ट करने वाली उपइकाइयां निश्चित दरों पर लगातार संबद्ध और वियोजित की जाती हैं । इस तरह के मात्रात्मक पुल नीचे के रूप में तकनीक का उपयोग बाध्यकारी समानता को मापने जबकि बातचीत की ताकत का पता चलता है, बाइंडिंग कैनेटीक्स का अध्ययन कितनी तेजी से बातचीत होती है पर अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और प्रत्येक जटिल कैसे लंबे समय तक मौजूद कर सकते हैं. इसके अलावा, एक अतिरिक्त कारक की उपस्थिति में एक बातचीत के कैनेटीक्स को मापने, जैसे एक प्रोटीन विनिमय कारक या एक दवा के रूप में, मदद करता है तंत्र जिसके द्वारा बातचीत अन्य कारक द्वारा विनियमित है प्रकट, के लिए महत्वपूर्ण ज्ञान प्रदान जैविक और चिकित्सा अनुसंधान की उन्नति । यहां, हम एक प्रोटीन जटिल है कि एक उच्च आंतरिक संबद्धता दर है की बाध्यकारी कैनेटीक्स को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है और जल्दी से एक और प्रोटीन द्वारा वियोजित किया जा सकता है । विधि विट्रो में प्रोटीन परिसर के गठन की रिपोर्ट करने के लिए प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण का उपयोग करता है, और यह एक बंद प्रवाह fluorimeter पर वास्तविक समय में तेजी से एसोसिएशन और परिसर के वियोजन की निगरानी के लिए सक्षम बनाता है । इस परख का उपयोग करना, एसोसिएशन और प्रोटीन परिसर के वियोजन दर स्थिरांक quantified हैं ।
Introduction
जैविक गतिविधियों अंततः प्रोटीन से बाहर किया जाता है, जिनमें से ज्यादातर उचित जैविक कार्यों के लिए दूसरों के साथ बातचीत । एक कंप्यूटेशनल दृष्टिकोण का प्रयोग, प्रोटीन की कुल मात्रा मानव में प्रोटीन बातचीत ~ ६५०,०००1होने का अनुमान है, और इन बातचीत के विघटन अक्सर2रोगों की ओर जाता है । सेलुलर और जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने में उनकी आवश्यक भूमिकाओं के कारण, कई तरीकों को प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, जैसे कि खमीर-दो-हाइब्रिड, बाइआण्विक प्रतिदीप्ति पूरकता, विभाजन-ल्यूसिफेरेज़ पूरकता, और सह-इम्यूनोरेसिसिटेशन परख3. हालांकि इन तरीकों की खोज और प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की पुष्टि करने में अच्छा कर रहे हैं, वे आम तौर पर गैर मात्रात्मक है और इस प्रकार बातचीत प्रोटीन भागीदारों के बीच समानता के बारे में सीमित जानकारी प्रदान करते हैं । मात्रात्मक पुल-चढ़ाव का उपयोग बाध्यकारी समानता (उदा., वियोजन स्थिरांक Kd) को मापने के लिए किया जा सकता है, लेकिन यह बाइंडिंग के कैनेटीक्स को मापने नहीं देता है, न ही इसे लागू किया जा सकता है जब Kd अपर्याप्त होने के कारण बहुत कम है सिगनल-से-रव अनुपात4. सतह plasmon अनुनाद (spr) स्पेक्ट्रोस्कोपी बाध्यकारी कैनेटीक्स quantifies, लेकिन यह एक विशिष्ट सतह और सतह पर एक अभिकारक के स्थिरीकरण की आवश्यकता है, जो संभावित अभिकारक5की बाध्यकारी संपत्ति बदल सकते हैं. इसके अलावा, यह spr के लिए मुश्किल है तेजी से एसोसिएशन और वियोजन दर5उपाय, और यह उचित spr का उपयोग करने के लिए एक प्रोटीन परिसर में प्रोटीन उपइकाइयों का आदान प्रदान की घटना की विशेषता नहीं है । यहां, हम एक तरीका है कि प्रोटीन की दरों को मापने की अनुमति देता है का वर्णन जटिल विधानसभा और disassembly एक मिलीसेकंड समय पैमाने पर. यह विधि सीullin-एकssociated-Nedd8-dissociated प्रोटीन 1 (Cand1) के रूप में एफ बॉक्स प्रोटीन विनिमय कारक6,7की भूमिका निर्धारित करने के लिए आवश्यक था ।
Cand1 Skp1 की गतिशीलता को विनियमित करता है • Cul1 • एफ-बॉक्स प्रोटीन (scf) E3 ligases, जो cullin-अंगूठी बैरि itin ligases के बड़े परिवार से संबंधित हैं । scfs cullin Cul1, जो अंगूठी डोमेन प्रोटीन Rbx1 बांध से मिलकर बनता है, और एक विनिमेय एफ बॉक्स प्रोटीन है, जो substrates और8Skp1 एडेप्टर प्रोटीन के माध्यम से Cul1 बांधता है । एक E3 ligase के रूप में, scf अपने सब्सट्रेट करने के लिए बैरि itin के विकार catalyzes, और यह सक्रिय है जब सब्सट्रेट एफ बॉक्स प्रोटीन द्वारा भर्ती किया जाता है, और जब Cul1 द्वारा संशोधित किया जाता है बैरि-प्रोटीन की तरह Nedd89। Cand1 असंशोधित Cul1 बाइंड कर देता है, और बाध्यकारी पर, यह दोनों के सहयोग को बाधित करता है Skp1 • एफ बॉक्स Cul1 के साथ प्रोटीन और Nedd810,11,12,13के लिए Cul1 के विकार । नतीजतन, Cand1 विट्रो में scf गतिविधि के एक अवरोधक होने के लिए दिखाई दिया, लेकिन जीवों में Cand1 की कमी दोष है कि वीवो में scf गतिविधियों को विनियमित करने में Cand1 की एक सकारात्मक भूमिका का पता चलता है के कारण14,15,16 , 17. यह विरोधाभास अंत में एक मात्रात्मक अध्ययन है कि Cul1, Cand1, और Skp1 • एफ बॉक्स प्रोटीन के बीच गतिशील बातचीत से पता चला द्वारा समझाया गया था । प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा अंतरण (fret) assays कि scf और Cul1 • Cand1 परिसरों के गठन का पता लगाने का उपयोग करना, एसोसिएशन और वियोजन दर स्थिरांक (कश्मीरपर और कश्मीरबंद, क्रमशः) थे व्यक्तिगत रूप से मापा । माप से पता चला है कि दोनों Cand1 और Skp1 • एफ बॉक्स प्रोटीन Cul1 के साथ बेहद तंग जटिल फार्म, लेकिन scf के बंद कश्मीर नाटकीय रूप से Cand1 और Cul1 केबंद कश्मीर से वृद्धि हुई है Cand1 • नाटकीय रूप से बढ़ जाती है द्वारा Skp1 • F-box प्रोटीन6,7. इन परिणामों के एक प्रोटीन विनिमय कारक है, जो पुराने scf परिसरों से Cul1 रीसाइक्लिंग के माध्यम से नए scf परिसरों के गठन catalyzes के रूप में Cand1 की भूमिका को परिभाषित करने के लिए प्रारंभिक और महत्वपूर्ण समर्थन प्रदान करते हैं ।
यहां, हम विकसित करने की प्रक्रिया और fret परख का उपयोग करने के लिए Cul1 • Cand1 परिसर7की गतिशीलता का अध्ययन वर्तमान, और एक ही सिद्धांत विभिंन biomolecules की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । fret तब होता है जब एक दाता उचित तरंग दैर्घ्य के साथ उत्साहित है, और उत्तेजना स्पेक्ट्रम अतिव्यापी दाता उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के साथ एक स्वीकारकर्ता 10-100 Å की दूरी के भीतर मौजूद है । उत्तेजित राज्य स्वीकारकर्ता को हस्तांतरित कर दिया जाता है, जिससे दाता की तीव्रता कम हो जाती है और स्वीकारकर्ता तीव्रता१८बढ़ जाती है. fret की दक्षता (ई) दोनों förster त्रिज्या पर निर्भर करता है (आर0) और दाता और स्वीकारकर्ता fluorophores (आर) के बीच की दूरी, और द्वारा परिभाषित किया गया है: e = r06/(r0 6 + आर6). förster त्रिज्या (R0) कुछ कारकों पर निर्भर करता है, द्विध्रुव कोणीय अभिविन्यास सहित, दाता-acceptor जोड़ी के वर्णक ओवरलैप, और समाधान का इस्तेमाल किया19. एक बंद-प्रवाह fluorimeter, जो वास्तविक समय में दाता उत्सर्जन के परिवर्तन पर नज़र रखता है और पर और कश्मीर केबंदतेजी से कश्मीर के मापन में सक्षम बनाता है पर fret परख लागू करने के लिए, यह कुशल fret स्थापित करने के लिए आवश्यक है कि दाता उत्सर्जन की एक महत्वपूर्ण कमी में परिणाम । इसलिए, डिजाइन कुशल fret फ्लोरोसेंट रंजक और साइटों के लक्ष्य प्रोटीन पर उपयुक्त जोड़ी का चयन करने के लिए रंजक संलग्न करने के लिए महत्वपूर्ण है और इस प्रोटोकॉल में चर्चा की जाएगी ।
Protocol
Representative Results
Discussion
fret एक भौतिक घटना है कि अध्ययन और समझने के लिए महान ब्याज की है जैविक प्रणालियों19। यहां, हम परीक्षण और fret का उपयोग करने के लिए दो बातचीत प्रोटीन की बाध्यकारी कैनेटीक्स का अध्ययन करने के लिए एक प्र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम शू-Ou शान (कैलिफोर्निया प्रौद्योगिकी संस्थान) के लिए fret परख के विकास पर व्यावहारिक चर्चा के लिए धंयवाद । एमजी, y.z., और x.l. को स्टार्टअप फंडों द्वारा प्रड़े विश्वविद्यालय से y.z. और एक्स. एल द्वारा वित्त पोषित किया गया था । इस काम के हिस्से में संयंत्र जीव विज्ञान के लिए purdue विश्वविद्यालय केंद्र से एक बीज अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Anion exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505301 | HiTrap Q FF anion exchange chromatography column |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | 2231000511 | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | ThermoFisher Scientific | C600003 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C78-500 | |
| Cation exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505401 | HiTrap SP Sepharose FF |
| Desalting Column | GE Healthcare | 17085101 | |
| Floor model centrifuge (high speed) | Beckman Coulter | J2-MC | |
| Floor model centrifuge (low speed) | Beckman Coulter | J6-MI | |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html | |
| FluoroMax fluorimeter | HORIBA | FluoroMax-3 | |
| FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| GGGGAMC peptide | New England Peptide | custom synthesis | |
| Glutathione beads | GE Healthcare | 17075605 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Fisher Scientific | 15-529-019 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Ovalbumin | MilliporeSigma | A2512 | |
| pGEX-4T-2 vector | GE Healthcare | 28954550 | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | 4693132001 | |
| Reduced glutathione | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Refrigerated shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Rosetta Competent Cells | MilliporeSigma | 70953-3 | |
| Size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 28990944 | Superdex 200 10/300 GL column |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Stopped-flow fluorimeter | Hi-Tech Scientific | SF-61 DX2 | |
| TCEP·HCl | Fisher Scientific | PI20490 | |
| Thrombin | MilliporeSigma | T4648 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Ultrafiltration membrane | MilliporeSigma | UFC903008 | Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL |
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