Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala
Summary
Protein-protein interaktioner är avgörande för biologiska system, och studier av den bindande kineticsen tillföra insikter och dynamik och funktion av proteinkomplex. Vi beskriver en metod som kvantifierar de kinetiska parametrarna i ett proteinkomplex med fluorescens resonans energiöverföring och slutat-flow teknik.
Abstract
Proteiner är de primära aktörerna av biologiska system, och de interagerar oftast med andra makro- eller små molekyler att utföra deras biologiska funktioner. Sådana interaktioner kan vara mycket dynamisk, vilket innebär samverkande subunitsna ständigt associerade och dissocierade på vissa priser. Medan mäta det affinitet med tekniker såsom kvantitativa nedrullningsbara avslöjar styrkan i interaktionen, studera bindande kinetik ger insikter om hur snabba de inträffar och hur länge varje komplex kan existera. Dessutom mäta kineticsen av en interaktion i närvaro av ytterligare en faktor, såsom en protein exchange faktor eller en drog, hjälper till att avslöja den mekanism genom vilken samverkan regleras i den andra faktorn, som ger viktig kunskap för de befordran av biologisk och medicinsk forskning. Här beskriver vi ett protokoll för mätning av bindande kineticsen av ett proteinkomplex som har en hög inneboende association och snabbt kan särskiljas genom ett annat protein. Metoden använder fluorescens resonans energiöverföring för att rapportera bildandet av protein komplex in vitro-, och det möjliggör övervakning snabb föreningen och dissociation av anläggningen i realtid på en stoppad-flow fluorimeter. Med denna analys, är i föreningen och dissociation konstanter av protein komplex kvantifierade.
Introduction
Biologiska aktiviteter utförs i slutändan av proteiner, mest som interagerar med andra för korrekt biologiska funktioner. Med en tillämpad metod, den totala mängden protein-protein interaktioner i mänskliga uppskattas till ~ 650,0001, och störningar av interaktionerna ofta leder till sjukdomar2. På grund av deras viktiga roller i styr cellulära och organismers processer, har många metoder utvecklats för att studera protein-protein interaktioner, såsom jäst-två-hybrid, bimolecular fluorescens komplettering, split-luciferas komplettering och co-immunoprecipitation assay3. Medan dessa metoder är bra på att upptäcka och bekräfta protein-protein interaktioner, de är vanligtvis icke-kvantitativa och således ger begränsad information om samhörigheten mellan de samverkande partnerna som protein. Kvantitativa rullgardinsmenyerna kan användas för att mäta affinitet (t.ex. dissociationskonstant Kd), men den mäter inte kineticsen av bindningen, inte heller kan det tillämpas när den Kd är mycket låg på grund av en otillräcklig signal-brus-förhållande4. Ytan plasmon resonans (SPR) spektroskopi kvantifierar bindande kinetik, men det kräver en specifik yta och immobilisering av en reaktant på ytan, vilket potentiellt kan ändra egenskapen bindande av reaktant5. Dessutom är det svårt för SPR att mäta snabb association och dissociation priser5, och det är inte lämpligt att använda SPR för att karakterisera i händelse av utbyte av proteinsubenheter i ett proteinkomplex. Här beskriver vi en metod som möjliggör mätning av protein komplex sammansättnings- och uppdelningsorder på en millisekund tidsskala. Denna metod var nödvändigt för att fastställa Cullin –enmarknadsbedömningar –Nedd8 –dissociated protein 1 (Cand1) roll som F-låda protein exchange faktor6,7.
Cand1 reglerar dynamiken i Skp1•Cul1•F-box protein (SCF) E3 ligases, som tillhör den stora familjen av Cullin-RING ubiquitin ligases. SCFs består av den cullin Cul1, som binder proteinet RING domän Rbx1, och en utbytbar F-låda-protein, som rekryterar substrat och binder Cul1 via adapter proteinet Skp18. Som en E3-ligase, SCF katalyserar konjugationen av ubiquitin till dess substrat, och det aktiveras när substratet rekryteras av proteinet F-låda, och när Cul1 ändras av ubiquitin-liknande proteinet Nedd89. Cand1 binder oförändrad Cul1, och vid bindning, det stör både Föreningen för Skp1•F-box protein med Cul1 och konjugationen av Nedd8 till Cul110,11,12,13. Som ett resultat, Cand1 tycktes vara en hämmare av SCF aktivitet in vitro-, men Cand1 brist i organismer orsakade defekter som tyder på en positiv roll för Cand1 reglera SCF aktiviteter i vivo14,15,16 , 17. denna paradox förklarades slutligen av en kvantitativ studie som avslöjade de dynamiska samspel mellan Cul1, Cand1 och Skp1•F-box protein. Med hjälp av fluorescens resonans energi överföring (bandet) analyser som upptäcka bildandet av SCF och Cul1•Cand1 komplex, föreningen och dissociation Betygsätt konstanter (kpå och koff, respektive) var mäts individuellt. Mätningarna visade att både Cand1 och Skp1•F-box protein form extremt tight komplex med Cul1, men det koff av SCF är dramatiskt ökade Cand1 och den koff av Cul1•Cand1 är dramatiskt ökat av Skp1•F-box protein6,7. Dessa resultat ger det ursprungliga och kritiska stödet för att definiera rollen av Cand1 som en protein exchange faktor, som katalyserar bildandet av nya SCF komplex genom återvinning Cul1 från de gamla SCF-komplex.
Här presenterar vi förfarandet för att utveckla och använda bandet analysen för att studera dynamiken i den komplexa Cul1•Cand1-7, och samma princip kan användas för att studera dynamiken i olika biomolekyler. FRET uppstår när en donator är glada med lämplig våglängd och en acceptor med excitation spektrum överlappande den givaren emissionsspektrum finns inom ett avstånd av 10-100 Å. Upphetsad staten överförs till den acceptor, därmed minskar givare intensiteten och ökande intensitet acceptanten18. (E) bandet effektivitet beror på både Förster radien (R0) och avståndet mellan givaren och acceptor fluorophores (r), och definieras av: E = R06/ (R0 6 (+ r6). Förster radien (R0) beror på några faktorer, inklusive dipol kantiga orientering, spektrala överlappningen av givare-acceptor paret, och lösningen används19. För att applicera bandet analysen på en stoppad-flow fluorimeter, som övervakar ändringen av givare utsläpp i realtid och möjliggör mätningar av snabba kpå och koff, det är nödvändigt att fastställa effektiva bandet som resulterar i en betydande minskning av givare utsläpp. Därför utforma effektiva bandet genom att välja den lämpliga par fluorescerande färgämnen och platser på target proteiner att fästa färgämnena är viktigt och kommer att diskuteras i detta protokoll.
Protocol
Representative Results
Discussion
BANDET är ett fysiskt fenomen som är av stort intresse för att studera och förstå biologiska system19. Här presenterar vi ett protokoll för att testa och använda bandet för att studera bindande kineticsen av två samverkande proteiner. När du utformar FRET, ansåg vi tre viktiga faktorer: spektrala överlappningen mellan givare utsläpp och acceptor excitation, avståndet mellan de två fluorophores och dipol orientering i fluorophores28. Välj fluorophores för b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Shu-Ou Shan (California Institute of Technology) för insiktsfull diskussion om utvecklingen av bandet analysen. M.G., Y.Z. och X.L. har finansierats genom start medel från Purdue University till Y.Z. och X.L.This arbete var stöds delvis av ett frö bidrag från Purdue University Center för växtbiologi.
Materials
| Anion exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505301 | HiTrap Q FF anion exchange chromatography column |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | 2231000511 | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | ThermoFisher Scientific | C600003 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C78-500 | |
| Cation exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505401 | HiTrap SP Sepharose FF |
| Desalting Column | GE Healthcare | 17085101 | |
| Floor model centrifuge (high speed) | Beckman Coulter | J2-MC | |
| Floor model centrifuge (low speed) | Beckman Coulter | J6-MI | |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html | |
| FluoroMax fluorimeter | HORIBA | FluoroMax-3 | |
| FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
| GGGGAMC peptide | New England Peptide | custom synthesis | |
| Glutathione beads | GE Healthcare | 17075605 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Fisher Scientific | 15-529-019 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Ovalbumin | MilliporeSigma | A2512 | |
| pGEX-4T-2 vector | GE Healthcare | 28954550 | |
| Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | 4693132001 | |
| Reduced glutathione | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Refrigerated shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Rosetta Competent Cells | MilliporeSigma | 70953-3 | |
| Size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 28990944 | Superdex 200 10/300 GL column |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Stopped-flow fluorimeter | Hi-Tech Scientific | SF-61 DX2 | |
| TCEP·HCl | Fisher Scientific | PI20490 | |
| Thrombin | MilliporeSigma | T4648 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Ultrafiltration membrane | MilliporeSigma | UFC903008 | Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL |
References
- Stumpf, M. P. H., et al. Estimating the size of the human interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).
- Kuzmanov, U., Emili, A. Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems. Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).
- Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities. Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).
- Lapetina, S., Gil-Henn, H. A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays. Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).
- Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).
- Pierce, N. W., et al. Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins. Cell. 153 (1), 206-215 (2013).
- Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression. Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).
- Zheng, N., et al. Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex. Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).
- Kleiger, G., Deshaies, R. Tag Team Ubiquitin Ligases. Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).
- Zheng, J., et al. CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex. Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).
- Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation. FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).
- Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).
- Goldenberg, S. J., et al. Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases. Cell. 119 (4), 517-528 (2004).
- Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase. Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).
- Feng, S., et al. Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation. the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).
- Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).
- Lo, S. -. C., Hannink, M. CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1. Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).
- Okamoto, K., Sako, Y. Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).
- Hussain, S. A. An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET). arXiv preprint. , (2009).
- Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases. Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).
- Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. Sortagging: A versatile method for protein labeling. Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).
- Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation. Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
- Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates. Cell. 139 (5), 957-968 (2009).
- Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).
- Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins. Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).
- Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
- Lin, C. T., Rorabacher, D. B. Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell. Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).
- Toseland, C. P., Geeves, M. A. Rapid Reaction Kinetic Techniques. Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Lin, C. W., Ting, A. Y. Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells. Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).
- Yin, J., et al. Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).
- Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Development, Growth & Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).
- Kilic, S., et al. Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting. Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).
- Bajar, B. T., et al. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).
