نموذج زراعة الأنسجة فيفو السابقين لمضاعفات فيبروفاسكولار في اعتلال الشبكية السكري التكاثري
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لدراسة الفسيولوجيا المرضية لاعتلال الشبكية السكري التكاثري باستخدام الأنسجة المستمدة من المريض، واقتطعت جراحيا، فيبروفاسكولار للنسيج الأصلي ثلاثية الأبعاد توصيف والسابقين فيفو ثقافة. هذا السابقين فيفو ثقافة النموذجي أيضا قابلة للاختبار أو تطوير علاجات جديدة.
Abstract
اعتلال الشبكية السكري (DR) مضاعفات microvascular الأكثر شيوعاً من داء السكري وواحدة من أبرز أسباب العمى في البالغين سن العمل. لا توجد نماذج حيوانية الحالية من مرض السكري واعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين وضع التغييرات التدريجية الكاملة تتجلى في اعتلال الشبكية السكري التكاثري البشري (PDR). ولذلك، اعتمدت فهم منشأ المرض والفيزيولوجيا المرضية إلى حد كبير على استخدام مقاطع نسيجية وعينات الزجاجي في النهج التي لا تقدم سوى معلومات الحالة المستقرة على العوامل المسببة للأمراض المشتركة. تزايد الأدلة يشير إلى أن دينامية خلية-خلية وتفاعلات المصفوفة خارج الخلية الخلية (ECM) في السياق ميكرونفيرونمينتس ثلاثية الأبعاد (3D) ضرورية للدراسات الميكانيكية والفنية نحو تطوير جديدة استراتيجيات العلاج. ولذلك، افترضنا أنه يمكن الاستفادة من الأنسجة فيبروفاسكولار المرضية جراحيا اقتطعت من العيون مع الديمقراطية الشعبية موثوق كشف الآليات الخلوية والجزيئية لهذا المرض المدمر واختبار إمكانات الرواية السريرية التدخلات. تحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير طريقة جديدة ل 3D السابقين فيفو ثقافة اقتطعت جراحيا المستمدة من المريض فيبروفاسكولار الأنسجة (قدم)، التي ستكون بمثابة نموذج ذات صلة البشرية الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية. FTs تشريح في اكسبلانتس وجزءاً لا يتجزأ من مصفوفة فيبرينوجين للسابقين فيفو توصيف الثقافة و 3D. يسمح الفلورة الجامع-جبل FTs الأصلية والثقافات نقطة النهاية تحقيقا دقيقا في تكوين الأنسجة وعمليات متعددة الخلايا، وتسليط الضوء على أهمية توصيف مستوى الأنسجة ثلاثية الأبعاد للكشف عن ميزات ذات الصلة الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية. سيسمح هذا النموذج المتزامن تقييم الآليات الجزيئية والخلوية/الأنسجة العمليات وعلاج الاستجابات في سياق معقدة من التفاعلات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية داخل هندسة الأنسجة الديمقراطية الشعبية والمكرويه. حيث يلخص هذا النموذج الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية، سيكون أيضا قابلة للاختبار أو تطوير علاجات جديدة.
Introduction
الدكتور هو مضاعفات مرض السكري، مرض الذي وصل إلى أبعاد هائلة في العقود الثلاثة الماضية1العين خطيرة. بعد عشرين عاماً على التشخيص، وتقريبا كل مريض بداء السكري من النوع 1 و 60% من المرضى بالنوع 2 من داء السكري علامات هذا اعتلال الشبكية، مما يجعل مرض السكري في حد ذاته واحداً من أبرز الأسباب للعمى في العمل البالغين سن2. وفقا لمستوى انحطاط ميكروفاسكولار والأضرار الدماغية، يصنف الدكتور إلى الدكتور غير التكاثري (غير الديمقراطية)، والدكتور التكاثري (PDR). نهاية مرحلة المرض، الديمقراطية، يتسم بالناجم عن الاسكيمية، والتهاب نيوفاسكولاريزيشن والردود تليفية في واجهة زجاجي شبكي. في ظروف غير المعالجة، وسوف تؤدي هذه العمليات إلى العمى بسبب نزف الزجاجي وتليف الشبكية وانفصال الشبكية تراكشونال ونيوفاسكولار الزرق3،4. وعلى الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا، تستهدف خيارات العلاج الحالي سوى الدكتور المراحل، بما في ذلك السكري وذمة بقعيه والديمقراطية الشعبية، عند تلف الشبكية وقد تبع ذلك الفعل. وعلاوة على ذلك، أن نسبة كبيرة من مرضى الدكتور لا تستفيد من عتاد العلاج الحالي، تشير إلى حاجة ملحة لتحسين العلاجات4،،من56.
متعددة أخرى أنافيفو ن المرض/الإنمائية نماذج ونماذج حيوانية السكري قد وضعت حتى الآن، ولكن أيا منها لا يجمل النطاق الكامل لميزات باثولوجي في7،الديمقراطية الشعبية البشرية8. وعلاوة على ذلك، أدلة متزايدة تشير إلى أن الاستجابات العلاج ترتبط محكم لتشكيل إدارة المحتوى في المؤسسة، وكذلك الترتيب المكاني والتفاعل بين المكروية الخلوية واللاخلوي9. ونحن لذلك وضعت لتطوير نموذج ذات صلة سريرياً للديمقراطية الشعبية البشرية عن طريق استخدام المواد المرضية FT التي هي عادة اقتطعت من عيون تمر الاستئصال الكلي الزجاجية كجزء من إدارة العمليات الجراحية للديمقراطية الشعبية10.
يصف هذه المخطوطة البروتوكول ل 3D السابقين فيفو ثقافة وتوصيف جراحيا-اقتطعت، الديمقراطية الشعبية المريض-المستمدة FT المرضية. وقد استخدمت الأسلوب الموصوفة هنا في منشور صدر مؤخرا أثبتت نجاح تفكيك الديمقراطية الشعبية 3D الأصلية الأنسجة المناظر الطبيعية، وخلاصة من سمات الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية بما في ذلك الأوعية وردود تليفية غير طبيعي 11من هياكل الأوعية الدموية. وكشف هذا النموذج أيضا تقتصر رواية من الميزات التي لا يمكن بسهولة تقدير من أقسام نسيجية رقيقة، مثل مكانياً المبرمج والانتشار، فضلا عن تشكيل الأوعية الدموية جزيرة11. السائل الزجاجي وقد استخدمت بنجاح من قبل الآخرين على الثقافات كروي غشائي ثلاثية الأبعاد لتقييم به الأوعية المحتملة ونجاعة أنجيوستاتيك جزيئات12. عندما يتم دمجها مع في المختبر 3D غشائي اللمفاوية خلية (LEC) كروي تنتشر المقايسة تستخدم الديمقراطية الشعبية زجاجي كمنشط، نموذجنا كشف عوامل مساهمة كلا فيتريل القابلة للذوبان العظة كذلك المحلية داخل الأنسجة نيوفاسكولار إلى حتى الآن غير مفهومة LEC المشاركة في الديمقراطية الشعبية الفيزيولوجيا المرضية3،11. جراحة زجاجي شبكي في إدارة الديمقراطية الشعبية، إجراء المؤداة بعد التحدي بشكل روتيني. كما هي رؤية الأدوات الجراحية وأساليب النهوض المستمر والتطور، إزالة عينة التكاثري فيبروفاسكولار في الوقت المناسب والمحافظة ليس فقط بتحسين نتائج الرؤية ولكن أيضا يوفر مواد النسيج لا تقدر بثمن تحقيق الديمقراطية الشعبية استجابات الفيزيولوجيا المرضية والعلاج في الجوانب المعقدة متعدية الجنسيات المكروية أنسجة بشرية حية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وبالنظر إلى أهمية المكروية الأنسجة ذات الصلة للخلية الفنية موثوق بها والنتائج الميكانيكية الجزيئية، يتحتم إيجاد النماذج التجريبية المناسبة التي توفر هذه البيئة الأنسجة. هذه الوثيقة وصف السابقين فيفو الديمقراطية الشعبية ثقافة نموذج FTs جزءا لا يتجزأ من فيبرينوجين يسمح التحقيق في آل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب نشعر بامتنان بالغ للزملاء الشبكية الطبية والجراحية والممرضات والموظفين كله “وحدة السكري” و “وحدة جراحة زجاجي شبكي” في قسم لطب العيون، مستشفى جامعة هلسنكي للمشاركة بنشاط في تجنيد من المرضى. ونشكر “بيوميديكوم وحدة التصوير الجزيئي” لمرافق التصوير. ونحن نشكر تشيرنينكو أناستاسيا للمساعدة التقنية الممتازة. كان يؤيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من أكاديمية فنلندا (كوالا لمبور)، جامعة هلسنكي (كوالا لمبور)، سيغريد جوسيليوس مؤسسة (كوالا لمبور)، ك ألبين يوهانسون مؤسسة (كوالا لمبور)، ومعهد السرطان الفنلندية (كوالا لمبور)، ومعهد كارولينسكا (كوالا لمبور)، الفنلندية العين مؤسسة (SL)، العين و مؤسسة مصرف الأنسجة (SL)، وماري وجورج جيم اهرنروت مؤسسة (SL)، ومنح البحوث السريرية هوك (TYH2018127 بعد TYH2016230، م)، مؤسسة أبحاث مرض السكري (SL، كوالا لمبور، حزب العدالة والتنمية، مثلاً)، فضلا عن برنامج الدكتوراه في “الطب الحيوي” (مثلاً).
Materials
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels – Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
- Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
- Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
- Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
- Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
- Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
- Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
- Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
- Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
- Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
- Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
- Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
- Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
- Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
- Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
- Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
- Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
- Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
- Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).
