Ein Ex-Vivo-Gewebekultur-Modell für fibrovaskulärem Komplikationen bei proliferativer diabetischer Retinopathie
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Pathophysiologie der proliferativen diabetischen Retinopathie mit Patienten abgeleitet, chirurgisch herausgeschnitten, fibrovaskulärem Gewebe für dreidimensionale nativen Gewebe Charakterisierung und Ex-Vivo-Kultur zu studieren. Diese ex-Vivo-Kultur-Modell ist auch für Tests oder Entwicklung neuer Behandlungsmethoden.
Abstract
Diabetischer Retinopathie (DR) ist die häufigste mikrovaskuläre Komplikation des Diabetes und eines der führenden Ursachen für Erblindung im erwerbsfähigen Alter Erwachsene. Keine aktuellen Tiermodellen für Diabetes und Sauerstoff-induzierte Retinopathie entwickeln die Fullrange-progressive Veränderungen in menschlichen proliferative diabetische Retinopathie (PDR) manifestiert. Daher hat Verständnis für die Krankheit Pathogenese und Pathophysiologie stützte sich weitgehend auf den Einsatz von histologischen Abschnitte und Glaskörper Proben in den Ansätzen, die nur stationäre Informationen über die beteiligten pathogenen Faktoren. Erhöhung der Beweis zeigt an, dass dynamische Zell-Zell und Zelle-extrazelluläre Matrix (ECM) Interaktionen im Zusammenhang mit der dreidimensionalen (3D) Mikroumgebungen essentiell für die mechanistischen und funktionellen Studien zur Entwicklung der neu Behandlungsstrategien. Daher vermutet wir, dass die pathologische fibrovaskulärem Gewebe chirurgisch herausgeschnitten aus Augen mit PDR genutzt werden könnte, um zuverlässig die zellulären und molekularen Mechanismen dieser verheerenden Krankheit zu entwirren und das Potenzial für Roman klinischen testen Interventionen. Zu diesem Zweck entwickelten wir eine neuartige Methode für 3D ex-Vivo-Kultur der chirurgisch herausgeschnitten Patienten abgeleitet fibrovaskulärem Gewebe (FT), die als ein Modell der menschlichen PDR Pathophysiologie dienen wird. Die FTs in Explantaten zerlegt und eingebettet in Fibrin-Matrix für ex-Vivo-Kultur und 3D Charakterisierung. Vollständig-hängen Immunfluoreszenz der native FTs und Endpunkt Kulturen ermöglicht gründlichen Untersuchung der Zusammensetzung und mehrzelligen Prozesse, Hervorhebung der Bedeutung des 3D Gewebe-Ebene Charakterisierung für die Aufdeckung relevanten Merkmale der PDR Pathophysiologie. Dieses Modell ermöglicht die gleichzeitige Bewertung der molekularen, zellulären/Gewebe Prozesse und Behandlung Antworten im Zusammenhang mit komplexen dynamischen biochemischen und physikalischen Wechselwirkungen innerhalb der PDR Gewebearchitektur und Mikroumgebung. Da dieses Modell PDR Pathophysiologie rekapituliert, wird es auch zum Testen oder Entwicklung neuer Behandlungsmethoden zugänglich sein.
Introduction
DR ist eine schweren okulären Komplikation bei Diabetes, eine Krankheit, die in den letzten drei Jahrzehnten1enorme Ausmaße angenommen hat. Zwanzig Jahre nach Diagnose, praktisch jeder Patient mit Diabetes Typ 1 und 60 % der Patienten mit Typ 2 Diabetes vorliegenden Anzeichen von Retinopathie, machen Diabetes per se eine der führenden von Blindheit im Alter Erwachsene2arbeiten Ursachen. Nach dem Stand der mikrovaskuläre Degeneration und ischämischen Schäden ist DR in nicht-proliferative DR (PDR) und proliferative DR (PDR) eingeteilt. Die Ende-Stadium der Erkrankung, PDR, zeichnet sich durch Ischämie und Entzündung-induzierte Neovaskularisation und fibrotische Reaktionen an der vitreoretinalen Grenzfläche. In unbehandeltem Zustand werden diese Prozesse zur Erblindung aufgrund neovaskulären Glaukoms3,4, Glaskörperhämorrhagie, Netzhaut Fibrose und Verwindungskräfte Netzhautablösung führen. Trotz der jüngsten Fortschritte gezielt aktuelle Behandlungsmöglichkeiten nur DR Bühnen, darunter diabetischen Makulaödems und PDR, wenn Netzhaut Schaden bereits folgte hat. Darüber hinaus profitiert ein großer Teil der DR-Patienten nicht von aktuellen Behandlung Rüstzeug, zeigt einen dringenden Bedarf an verbesserten Therapien4,5,6.
Mehrere andere ichn Vivo Krankheit/Entwicklungsstörungen Modelle und diabetischen Tiermodell bisher entwickelt worden, aber keiner von ihnen rekapituliert das gesamte Spektrum der pathologischen Funktionen im menschlichen PDR7,8beobachtet. Darüber hinaus deutet auf zunehmende Beweise Behandlung Antworten der ECM Zusammensetzung als auch die räumliche Anordnung und Interaktion zwischen der zellulären und azellulärer Mikroumgebung9eng verbunden sind. Wir wollten daher um eine klinisch relevante Modell der menschlichen Laos zu entwickeln, durch die Nutzung der FT pathologischen Materials, das häufig aus einer Vitrektomie im Rahmen des chirurgischen Managements von PDR10Augen herausgeschnitten wird.
Dieses Manuskript beschreibt das Protokoll für die 3D ex-Vivo-Kultur und Charakterisierung der chirurgisch herausgeschnitten, PDR Patienten gewonnenen pathologischen FT. Die hier beschriebene Methode hat in einer kürzlich erschienenen Publikation verwendet wurden, die erfolgreiche Dekonstruktion der native 3D PDR Gewebe Landschaft und Zusammenfassung der Merkmale des PDR Pathophysiologie einschließlich angiogenen und fibrotische Reaktionen die abnorme nachgewiesen vaskulären Strukturen11. Dieses Modell zeigte auch, dass neue Features, die leicht von histologischen Dünnschliffe, wie räumlich geschätzt werden können nicht Apoptose und Proliferation sowie vaskuläre Inselchen Bildung11beschränkt. Glasigen Flüssigkeit wurde erfolgreich von anderen 3D endotheliale Sphäroid Kulturen, seine angiogenen Potenzial zu bewerten und die Wirksamkeit von Angiostatic Moleküle12eingesetzt. In Kombination mit einer in-vitro- 3D lymphatische Endothelzellen (LEC)-Sphäroid sprießen Assay mit PDR Glaskörper als Stimulans deckte unser Modell der Beitrag der beiden lösliche Glaskörperblutung sowie lokale Hinweise innerhalb des neovaskulären Gewebes zur Faktoren noch schlecht verstandenen LEC-Beteiligung an PDR Pathophysiologie3,11. Bei der Verwaltung der PDR ist vitreoretinalen Chirurgie routinemäßig durchgeführt und zugleich anspruchsvolle Verfahren. Wie chirurgische Instrumentierungen und Techniken kontinuierliche Weiterentwicklung und Raffinesse erleben, rechtzeitig und konservativen Entfernung von fibrovaskulärem proliferative Muster verbessert nicht nur die Vision Ergebnis, sondern auch von unschätzbarem Wert Gewebematerial für die Untersuchung der PDR Pathophysiologie und Behandlung Reaktionen in komplexen translationale Aspekte des lebender menschlicher Gewebe Mikroumgebung.
Protocol
Representative Results
Discussion
In Anbetracht der Bedeutung der entsprechenden Gewebe Mikroumgebung für zuverlässige funktionelle Zelle und molekulare mechanistischen Ergebnisse ist es unerlässlich, entsprechende experimentelle Modelle finden, die diese Gewebe-Umfeld zu schaffen. Die hierin beschriebenen ex Vivo PDR Kultur Modell für das Fibrin eingebettet FTs ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen der PDR Pathophysiologie im native, komplex und mehrzelligen Rahmen der PDR klinischen Proben.
Wichtige Schri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind sehr dankbar, die medizinische und chirurgische Netzhaut Kollegen, Krankenschwestern und Belegschaft von diabetischen und vitreoretinalen Chirurgie-Einheit an der Abteilung für Augenheilkunde, Helsinki University Hospital für aktive Teilnahme an der Rekrutierung der Patienten. Wir danken Biomedicum Molecular Imaging Unit für bildgebende Einrichtungen. Wir danken Anastasiya Chernenko für hervorragende technische Unterstützung. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse von Akademie von Finnland (KL), Universität Helsinki (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), finnische Krebs-Institut (KL), Karolinska Institutet (KL), finnische Eye Foundation (SL), Auge und Gewebe-Bank-Stiftung (SL), Maria und Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) und HUCH klinische Forschung Bewilligungen (TYH2018127 nach TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) sowie das Doktoratsstudium in Biomedizin (EG).
Materials
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels – Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
- Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
- Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
- Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
- Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
- Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
- Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
- Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
- Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
- Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
- Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
- Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
- Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
- Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
- Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
- Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
- Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
- Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
- Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).
