מודל תרביות רקמה לשעבר Vivo עבור סיבוכים Fibrovascular Proliferative רטינופתיה סוכרתית
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד הפתופיזיולוגיה של רטינופתיה סוכרתית proliferative באמצעות רקמות החולה נגזר, טוחנות בניתוח, fibrovascular לתרבות vivo לשעבר ואפיון רקמות יליד תלת מימדי. Ex-vivo תרבות דגם זה גם לשכנוע בדיקה או לפתח טיפולים חדשים.
Abstract
רטינופתיה סוכרתית (ד ר) microvascular. הסיבוך הנפוץ ביותר של מחלת הסוכרת, אחד המובילים גורמת לעיוורון אצל מבוגרים בגיל העבודה. אין מודלים בבעלי חיים הנוכחי של סוכרת, רטינופתיה חמצן-induced לפתח את השינויים מתקדמת טווח מלא בא לידי ביטוי אנושי proliferative רטינופתיה סוכרתית (PDR). לכן, הבנה של המחלה פתוגנזה ו פתופסיולוגיה הסתמכה בעיקר על השימוש של מקטעים היסטולוגית ודוגמאות בזגוגית, גישות מספקים רק מידע מצב יציב על הגורמים פתוגניים המעורבים. הוכחה גוברת מציין כי התא דינמי-תא ואינטראקציות מטריצה חוץ-תאית תא (ECM) בהקשר של תלת מימד (3D) microenvironments הם חיוניים עבור המחקרים מכניסטית ופונקציונליים לקראת הפיתוח חדש אסטרטגיות טיפול. לכן, שיערנו כי יכול להיות מנוצל הרקמה fibrovascular פתולוגית טוחנות בניתוח עיניים עם PDR לפענח בצורה אמינה את המנגנונים תאית ומולקולרית של המחלה ההרסנית הזאת, כדי לבחון את פוטנציאל קליני רומן התערבויות. למטרה זאת, פיתחנו שיטה עבור תלת-ממד ex-vivo תרבות של טוחנות בניתוח החולה נגזר fibrovascular רקמה (FT), אשר ישמש מודל הרלוונטיים של פתופסיולוגיה PDR האנושי. FTs ביתר explants, בתוך מטריצת פיברין ex-vivo אפיון תרבות ותלת מימד. Immunofluorescence כולה-הר של FTs יליד ותרבויות מובילים מאפשר חקירה יסודית של רקמת חיבור ותהליכים multicellular, הדגשת חשיבות האפיון רקמות ברמת תלת-ממד עבור חשיפת התכונות הרלוונטיות של פתופסיולוגיה PDR. מודל זה יאפשר את ההערכה סימולטני של המנגנונים המולקולריים, תהליכים סלולרי/רקמות ותגובות לטיפול בהקשר מורכבים של אינטראקציות הביוכימי ופיזית דינאמיים בתוך PDR רקמות אדריכלות, microenvironment. מאז מודל זה recapitulates PDR פתופיזיולוגיה, זה יהיה גם לשכנוע בדיקה או לפתח טיפולים חדשים.
Introduction
ד ר הוא סיבוך עינית רציני של סוכרת, מחלה אשר הגיעה לממדים עצומים בשלושת העשורים האחרונים1. עשרים שנה אחרי האבחנה, כמעט בכל חולה עם סוכרת מסוג 1 ו- 60% של חולים עם סוג 2 סוכרת סימנים הנוכחי של רטינופתיה, הפיכת סוכרת כשלעצמה אחד המובילים גורמת לעיוורון בקרב עובדים מבוגרים גיל2. בהתאם לרמה של ניוון microvascular נזק איסכמי, מסווגים ד ר ד ר לא שגשוג (הלא-PDR) ואת ד ר המקדימות (PDR). המחלה בשלב הסופי, PDR, מאופיין כורוידאלית איסכמיה – ו דלקת-induced ותגובות שהותירה את הממשק vitreoretinal. בתנאי שלא טופלו, תהליכים אלה תוביל לעיוורון עקב דימום בזגוגית, פיברוזיס ברשתית, tractional הרשתיות ו- neovascular גלאוקומה3,4. למרות ההתקדמות, אפשרויות הטיפול הנוכחי התמקד רק ד ר בשלבים, כולל בצקת מקולרית סוכרתית ו- PDR, כאשר ברשתית יש כבר התפתח. יתר על כן, שיעור גדול של חולים ד ר לא תועלת armamentarium הטיפול הנוכחי, המציין צורך דחוף טיפולים משופרים4,5,6.
מרובות אניn vivo מחלות התפתחותיות מודלים אחרים, מודלים בעלי חיים סוכרתיים פותחו עד כה, אך אף אחד מהם לא recapitulates בטווח המלא של תכונות פיפטות שנצפו. PDR האנושי7,8. יתר על כן, הוכחה גוברת מציין כי הטיפול תגובות מחוברים בחוזקה את ההרכב ECM כמו גם סידור מרחבי ואינטראקציה בין הסלולר, acellular microenvironment9. לפיכך, אנו, פיתוח מודל הרלוונטית קלינית של PDR האנושי על-ידי ניצול החומר פתולוגיים מטרים הוא בדרך כלל טוחנות מעיני העוברים vitrectomy כחלק הנהלת PDR10כירורגי.
כתב יד זה מתאר הפרוטוקול עבור 3D ex-vivo תרבות, אפיון ניתוח-טוחנות, PDR החולה נגזר מטרים פתולוגי. השיטה המתוארת כאן נעשה שימוש בפרסום האחרונות הראו דקונסטרוקציה מוצלחת של הנוף רקמות PDR 3D מקורי, החוק הביוגנטי מהתכונות של פתופסיולוגיה PDR כולל האנגיוגנזה ותגובות שהותירה של פרובי מבנים וסקולרית11. מודל זה התגלה גם תכונות רומן לא יכול להיות בקלות מוערכת ממקטעים היסטולוגית דק, כגון במרחב מוגבל אפופטוזיס, התפשטות, כמו גם היווצרות כלי דם איון11. נוזל בזגוגית כבר בשימוש בהצלחה על תרבויות ספרואיד אנדותל תלת-ממד כדי להעריך שלה האנגיוגנזה פוטנציאליים והיעילות של מולקולות angiostatic12על ידי אחרים. בשילוב עם במבחנה 3D תא אנדותל הלימפה (לץ) ספרואיד הלבלוב assay באמצעות PDR הזגוגיות כמו ממריץ, המודל שלנו חשף שהתרומה של שני vitreal מסיסים גורמים כמו גם מקומיים כמו רמזים בתוך רקמת neovascular כדי כמו עדיין ממעטים להבין לץ מעורבות PDR פתופסיולוגיה3,11. ניהול של PDR, ניתוח vitreoretinal הוא הליך שגרתי שבוצעו עדיין מאתגרת. כפי instrumentations כירורגית וטכניקות רואים התקדמות רציפה ותחכום, הסרה שמרנית ובמועד של הדגימה proliferative fibrovascular לא רק משפר את החזון התוצאה, אלא גם מספק חומר רקמות שלא יסולא בפז חקירת PDR תגובות פתופיזיולוגיה וטיפול בהיבטים translational מורכבים של microenvironment רקמה אנושית חיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהתחשב החשיבות של רקמות הרלוונטיים microenvironment עבור תוצאות מכניסטית מולקולרית ותא פונקציונלי אמין, זה הכרחי כדי למצוא גרסאות ניסיוניות המתאימות המספקים סביבה זו רקמה. המתוארים במסמך זה שמחוץ PDR תרבות המודל FTs פיברין-מוטבע מאפשר החקירה על מנגנוני PDR פתופסיולוגיה בהקשר מקורית, מורכבים ול…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אסירי רשתית רפואי וכירורגי עמיתים, אחיות, כל הצוות של יחידת סוכרת, יחידת הניתוח Vitreoretinal מחלקת עיניים, בית החולים האוניברסיטאי הלסינקי עבור המשתתפים באופן פעיל בלשכת הגיוס של חולים. אנו מודים Biomedicum יחידת הדמיה מולקולרית על מתקני הדמיה. אנו מודים זולטן צ’רניינקו לסיוע טכני מעולה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים האקדמיה של פינלנד (KL), אוניברסיטת הלסינקי (KL), סיגריד Juselius קרן (KL), קרן ג’והנסון אלבין ק’ (KL), מכון הסרטן פינית (KL), קרולינסקה Institutet (KL), פינית העין קרן (SL), עין, קרן בנק רקמות (SL), מרי, קרן Ehrnrooth ג גאורג (SL) ו מענקי מחקר קליני HUCH (TYH2018127 לאחר TYH2016230, SL), לסוכרת (SL, KL, AK, למשל), כמו גם את תכנית הדוקטורט וההתערבות (למשל).
Materials
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels – Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
- Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
- Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
- Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
- Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
- Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
- Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
- Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
- Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
- Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
- Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
- Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
- Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
- Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
- Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
- Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
- Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
- Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
- Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
- Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).
