Un modelo de cultivo de tejidos Ex Vivo para las complicaciones Fibrovascular en la retinopatía diabética proliferativa
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de estudio de la fisiopatología de la retinopatía diabética proliferativa mediante el uso de los tejidos derivados del paciente quirúrgico suprimido, fibrovasculares de tejido nativo tridimensional caracterización y ex vivo la cultura. Esta ex modelo de cultura vivo también es favorable para probar o desarrollar nuevos tratamientos.
Abstract
Retinopatía diabética (RD) es la complicación microvascular más frecuente de la diabetes y una de las principales causas de ceguera en adultos en edad de trabajar. No actuales modelos animales de diabetes y la retinopatía inducida por el oxígeno convierten los cambios progresivos de gama completa que se manifiesta en humana retinopatía diabética proliferativa (PDR). Por lo tanto, comprensión de la patogénesis de la enfermedad y la patofisiología ha dependido en gran medida el uso de secciones histológicas y muestras de vítreas en planteamientos que sólo proporcionan información de estado de equilibrio en los factores patogénicos implicados. Creciente evidencia indica que célula dinámica e interacciones de la matriz extracelular de la célula (MEC) en el contexto de microambientes (3D) tridimensionales son esenciales para los estudios mecanicistas y funcionales para el desarrollo de nuevos estrategias de tratamiento. Por lo tanto, la hipótesis de que el tejido fibrovascular patológico suprimido quirúrgico de ojos con RDP podría utilizarse confiablemente desentrañar los mecanismos celulares y moleculares de esta enfermedad devastadora y poner a prueba el potencial clínico de la novela intervenciones. Hacia este fin, hemos desarrollado un novedoso método para 3D ex vivo cultura de suprimido quirúrgico derivados del paciente tejido fibrovascular (FT), que servirá como un modelo relevante de Fisiopatología humana de PDR. La FTs se diseca en explantes y embebida en matriz de fibrina para ex vivo cultura y 3D caracterización. Conjunto Monte inmunofluorescencia de la FTs nativos y culturas punto final permite investigación exhaustiva de la composición tisular y procesos multicelulares, destacando la importancia de la caracterización de nivel tejido 3D para descubrir características relevantes de Fisiopatología de la PDR. Este modelo permite la evaluación simultánea de los mecanismos moleculares, celulares y tejidos procesos y las respuestas al tratamiento en el contexto complejo de interacciones bioquímicas y físicas dinámicas dentro de la arquitectura del tejido PDR y el microambiente. Este modelo recoge Fisiopatología PDR, también será favorable para pruebas o desarrollo de nuevos tratamientos.
Introduction
DR es una grave complicación ocular de la diabetes, una enfermedad que ha alcanzado proporciones enormes en los últimos tres décadas1. Veinte años después de diagnosis, prácticamente todos los pacientes con diabetes tipo 1 y el 60% de los pacientes con tipo 2 diabetes presente las muestras de la retinopatía, que diabetes por sí uno de los principales causas de ceguera en adultos de edad2de trabajo. Según el nivel de degeneración microvascular y daño isquémico, DR se clasifica en RD no proliferativa (no democrática) y Rd proliferativa (RDP). La enfermedad, PDR, se caracteriza por la neovascularización inducida por la isquemia y la inflamación y respuesta fibrótica en la interfase vítreo-retina. En condiciones no tratadas, estos procesos conducirá a la ceguera debido a hemorragia vítrea, fibrosis retiniana, la separación retiniana del tractional y neovascular glaucoma3,4. A pesar de los avances recientes, las opciones actuales de tratamiento objetivo sólo DR etapas, incluso el edema macular diabético y PDR, daño retiniano ha ya se produjo. Por otra parte, una gran proporción de pacientes del Dr. no se beneficia del actual arsenal terapéutico de tratamiento, lo que indica una necesidad urgente de mejores terapias4,5,6.
Otros yovivo n modelos de enfermedad, del desarrollo y múltiples modelos animales diabéticos se han desarrollado hasta la fecha, pero ninguno de ellos recoge toda la gama de características patológicas observadas en humanos PDR7,8. Además, la creciente evidencia indica que las respuestas al tratamiento están conectadas firmemente a la composición del ECM, así como el arreglo espacial y la interacción entre el microambiente celular y acelular9. Nosotros, por lo tanto, para desarrollar un modelo clínico relevante de PDR humana utilizando el material patológico de FT que es suprimido comúnmente de ojos sometidos a vitrectomía como parte de la gerencia quirúrgica del PDR10.
Este manuscrito describe el protocolo para el 3D ex vivo cultura y caracterización de la quirúrgico-suprimido, PDR pies patológicos derivados del paciente. El método aquí descrito se ha utilizado en una publicación reciente que demostró éxito deconstrucción del nativo paisaje de tejido 3D de PDR y recapitulación de las características de la patofisiología PDR angiogénicos como respuesta fibrótica de la anormal estructuras vasculares11. Este modelo también reveló características novedosas que no pueden ser fácilmente apreciadas desde finas secciones histológicas, tales como espacialmente limitan apoptosis y proliferación, así como formación de islotes vasculares11. Líquido vítreo se ha utilizado con éxito por otras culturas esferoide endotelial 3D para evaluar su potencial angiogénico y la eficacia de angiostatic moléculas12. Cuando se combina con un esferoide de células endoteliales linfáticas 3D (LEC) en vitro brotación ensayo utilizando vítreo PDR como estimulante, nuestro modelo reveló que la contribución de ambos vitreal soluble factores claves así como locales en el tejido neovascular de la todavía mal entendida implicación de LEC en PDR Fisiopatología3,11. En la gestión de PDR, cirugía vitreorretiniana es un procedimiento rutinario realizado pero desafiante. Como instrumentación quirúrgica y técnicas están viendo continuo adelanto y sofisticación, eliminación oportuna y conservador de muestra proliferativo fibrovascular no sólo mejora el resultado de la visión sino que también proporciona material de tejido muy valiosa para la investigación de respuestas de la patofisiología y el tratamiento de la PDR en los aspectos complejos de la traslación del microambiente del tejido humano vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Considerando la importancia del microambiente del tejido relevante para celular funcional confiable y resultados mecanismos moleculares, es imperativo encontrar modelos experimentales apropiados que proporcionan el ambiente de este tejido. El PDR aquí descrito ex vivo cultura modelo de la FTs de fibrina incrustado permite la investigación de los mecanismos de la patofisiología PDR en el contexto nativo, complejo y pluricelular de las muestras clínicas del PDR.
Pasos críticos en e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están muy agradecidos a los colegas de retina médica y quirúrgica, enfermeras y todo personal de la unidad de diabéticos y la unidad de cirugía del Vitreoretinal en el Departamento de Oftalmología, Hospital Universitario de Helsinki para participar activamente en el reclutamiento de los pacientes. Agradecemos a Biomedicum unidad de imagen Molecular para las instalaciones de proyección de imagen. Agradecemos a Anastasiya Chernenko excelente asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por becas de la Academia de Finlandia (KL), Universidad de Helsinki (KL), Sigrid Juselius Fundación (KL), K. Albin Johansson Fundación (KL), Instituto Finlandés del cáncer (KL), Karolinska Institutet (KL), Fundación de ojo finlandés (SL), ojo y Fundación de banco de tejidos (SL), María y Georg C. Ehrnrooth Fundación (SL) y becas de investigación clínica en HUCH (TYH2018127 después de TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG), así como el programa de doctorado en biomedicina (EG).
Materials
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels – Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
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