Un modello di coltura del tessuto Ex Vivo per fibrovascolare complicazioni nella retinopatia diabetica proliferativa
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per studiare la fisiopatologia della retinopatia diabetica proliferativa utilizzando tessuti paziente-derivato, chirurgicamente asportato, fibrovascolare per coltura di tessuto nativo tridimensionale caratterizzazione ed ex vivo. Questo ex vivo modello di cultura è inoltre favorevole per il test o lo sviluppo di nuovi trattamenti.
Abstract
Retinopatia diabetica (Dott) è la complicazione microvascolare più comune di diabete e una delle principali cause di cecità negli adulti in età lavorativa. Nessuna correnti modelli animali di diabete e retinopatia indotta da ossigeno sviluppano i cambiamenti progressivi full range manifestati in umana retinopatia diabetica proliferative (PDR). Di conseguenza, comprensione della patogenesi della malattia e della patofisiologia si affida in gran parte l’uso di sezioni istologiche e campioni vitrosi negli approcci che forniscono solo informazioni allo steady-state sui fattori patogeni coinvolti. La prova aumentante indica che dinamico cellula-cellula e cellula matrice extracellulare (ECM) interazioni nel contesto di tridimensionale (3D) microambienti sono essenziali per gli studi meccanicistici e funzionali verso lo sviluppo di nuovi strategie di trattamento. Di conseguenza, abbiamo supposto che il tessuto fibrovascolare patologico asportato chirurgicamente da occhi con PDR poteva essere utilizzato per attendibilmente svelare i meccanismi cellulari e molecolari di questa malattia devastante e testare il potenziale per il romanzo clinica interventi. A tal fine, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per 3D ex vivo cultura di asportata chirurgicamente paziente-derivato tessuto fibrovascolare (FT), che servirà come un modello pertinente di fisiopatologia umana di PDR. La FTs sono dissecato in espianti e incorporato nella matrice di fibrina per ex vivo di cultura e 3D di caratterizzazione. Intero-monta immunofluorescenza di FTs nativo e culture End-Point permette un’indagine approfondita della composizione del tessuto e processi multicellulari, evidenziando l’importanza della caratterizzazione di tessuto-livello 3D per scoprire caratteristiche rilevanti di Patofisiologia PDR. Questo modello permetterà la valutazione simultanea di meccanismi molecolari, cellulari/tessuto processi e le risposte al trattamento nel contesto complesso di interazioni dinamiche biochimici e fisici all’interno dell’architettura tissutale PDR e microambiente. Poiché questo modello ricapitola patofisiologia PDR, anche sarà favorevole per il test o lo sviluppo di nuovi trattamenti.
Introduction
DR è una grave complicanza oculare del diabete, una malattia che ha raggiunto proporzioni enormi nell’ultimo trent’anni1. Vent’anni dopo la diagnosi, virtualmente tutti i pazienti con diabete di tipo 1 e il 60% dei pazienti con segni presenti di tipo 2 diabete di retinopatia, rendendo diabete per sé uno dei principali cause di cecità in età adulti2di lavoro. Secondo il livello di degenerazione microvascolare e danno ischemico, DR è classificata in DR non proliferativa (non-PDR) e DR proliferative (PDR). La malattia di stadio finale, PDR, è caratterizzata da neovascolarizzazione indotta da ischemia e infiammazione e fibrotiche risposte all’interfaccia vitreo-retinica. In condizioni non trattate, questi processi porterà alla cecità a causa di emorragia del vitreo, fibrosi retinica, distacco di retina trazionale e glaucoma neovascular3,4. Nonostante i recenti progressi, opzioni correnti di trattamento di destinazione solo DR tappe, tra cui edema maculare diabetico e PDR, quando già ne è danno retinico. Inoltre, una grande percentuale di pazienti DR non beneficia attuale armamentario di trattamento, che indica un urgente bisogno di terapie migliori4,5,6.
Più altri iovivo n malattia/modelli di sviluppo e modelli animali diabetici sono stati sviluppati fino ad oggi, ma nessuno di loro ricapitola l’intera gamma di caratteristiche patologiche osservate in human PDR7,8. Inoltre, la prova aumentante indica che le risposte al trattamento siano strettamente collegate nella composizione di ECM come pure la disposizione spaziale e l’interazione tra il microambiente cellulare e acellular9. Abbiamo, quindi, di sviluppare un modello clinicamente rilevante del PDR umano utilizzando materiale patologico FT che comunemente viene asportato da occhi sottoposti a vitrectomia come parte dell’amministrazione chirurgica di PDR10.
Questo manoscritto descrive il protocollo per il 3D ex vivo cultura e caratterizzazione della-asportata chirurgicamente, PDR paziente-derivato patologico FT. Il metodo qui descritto è stato utilizzato in una recente pubblicazione che ha dimostrato il successo decostruzione del nativo 3D paesaggio tessuto PDR e ricapitolazione delle caratteristiche di patofisiologia PDR inclusi angiogenici e fibrotiche risposte di anormale strutture vascolari11. Questo modello ha anche rivelato caratteristiche novelle che non possono essere facilmente apprezzati da sezioni istologiche sottili, come nello spazio limitano di apoptosi e proliferazione nonché vascolare isolotto formazione11. Liquido vitroso è stato utilizzato con successo di altri utenti su culture di sferoide endoteliale 3D per valutare il suo potenziale angiogenico e l’efficacia di angiostatic molecole12. Quando combinato con uno sferoide in vitro delle cellule endoteliali linfatiche 3D (LEC) analisi usando vitroso PDR come stimolante di germogliatura, nostro modello ha rivelato che il contributo di entrambi vitreal solubili fattori spunti anche come locale all’interno del tessuto neovascolare per as ancora capito male LEC coinvolgimento nel PDR patofisiologia3,11. Nella gestione del PDR, chirurgia vitreo-retinica è una procedura di routine eseguita ancora impegnativa. Come tecniche e strumentazioni chirurgiche sono vedendo avanzamento continuo e raffinatezza, rimozione tempestiva e conservatore di fibrovascolare proliferativa esemplare non solo migliora il risultato di visione ma fornisce anche materiale tissutale inestimabile per la indagine di risposte di patofisiologia e trattamento di PDR negli aspetti traslazionali complessi del microenvironment del tessuto umano vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Considerando l’importanza del microambiente tessuto pertinenti per affidabile e funzionale delle cellule e molecolare risultati meccanicistici, è imperativo trovare appropriati modelli sperimentali che forniscono questo ambiente di tessuto. Descritto nel presente documento ex vivo PDR cultura modello per FTs fibrina-incorporato consente l’indagine dei meccanismi della patofisiologia PDR nel contesto dei campioni clinici PDR nativo, complesso e pluricellulare.
Fasi critiche all’intern…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono molto grati ai colleghi di retina medica e chirurgica, infermieri e tutto il personale dell’unità diabetica e unità di chirurgia vitreo-retinica presso il reparto di oftalmologia, ospedale dell’Università di Helsinki per partecipare attivamente nel reclutamento dei pazienti. Ringraziamo Biomedicum unità di Imaging molecolare per le strutture di formazione immagine. Ringraziamo Anastasiya Chernenko per l’eccellente assistenza tecnica. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da Accademia di Finlandia (KL), Università di Helsinki (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), Istituto finlandese di cancro (KL), Karolinska Institutet (KL), finlandese Eye Foundation (SL), occhio e Fondazione Banca di tessuto (SL), Maria e Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) e assegni di ricerca clinica HUCH (TYH2018127 dopo TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) così come il programma di dottorato in biomedicina (EG).
Materials
| Material | |||
| Microforceps | Medicon | 07.60.03 | Used for handling the FTs |
| Disposable Scalpels – Sterile | Swann-Morton | 0513 | Used for FT dissection |
| Culture dish, vented, 28 ml (60mm) | Greiner Bio-One | 391-3210 | Used for dissection and for testing fibrin gel formation |
| Cell culture plates, 12-well | Greiner Bio-One | 392-0049 | Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL | Greiner Bio-One | 391-3477 | |
| Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL | Greiner Bio-One | 525-0384 | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF | Millipore | SLGV033RS | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606108V | Used to sterile-filter the fibrinogen solution |
| Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | Fisher | FB74031 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well | Nunc | 142475 | Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture |
| Cell culture plates, 96-well, U-bottom | Greiner Bio-One | 392-0019 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Used for whole-mount immunofluorescence |
| Coverslips 22x22mm #1 | Menzel/Fisher | 15727582 | Used for mounting |
| Microscope slides | Fisher | Kindler K102 | Used for mounting |
| Absorbent paper | VWR | 115-0202 | Used for mounting |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | Used for preparing 1x PBS |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Calbiochem | 341578 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H9394-500ML | Used for preparing the fibrinogen and TA solution |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | Used for preparing the blocking solution |
| Human Serum | Sigma-Aldrich | H4522 | Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media |
| Gentamicin Sulfate 10mg/ml | Biowest | L0011-100 | |
| Endothelial cell media MV Kit | Promocell | C-22120 | Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement, 500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL) |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-2.5L-M | Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood. |
| Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | T9284 | Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. |
| Hoechst 33342, 20mM | Life Technologies | 62249 | For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Eukitt Quick-hardening mounting medium | Sigma-Aldrich | 03989-100ml | TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood. |
| Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | T9549-500UN | Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder | Sigma | A3428 | Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth factors | |||
| Recombinant human VEGFA | R&D Systems | 293-VE-010 | 50 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human VEGFC | R&D Systems | 752-VC-025 | 200 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human TGFβ | Millipore | GF346 | 1 ng/ mL final concentration |
| Recombinant human bFGF | Millipore | 01-106 | 50 ng/ mL final concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary antibodies | |||
| CD31 (JC70A) | Dako | M0823 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD34 (QBEND10) | Dako | M716501-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD45 (2B11+PD7/26) | Dako | M070129-2 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| CD68 | ImmunoWay | RLM3161 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| Cleaved caspase-3 (5A1E) | Cell Signalling | 9664 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| ERG (EP111) | Dako | M731429-2 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| GFAP | Dako | Z0334 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Ki67 | Leica Microsystems | NCL-Ki67p | Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Lyve1 | R&D Systems | AF2089 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab |
| NG2 | Millipore | AB5320 | Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab |
| Prox1 | ReliaTech | 102-PA32 | Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab |
| Prox1 | R&D Systems | AF2727 | Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab |
| VEGFR3 (9D9F9) | Millipore | MAB3757 | Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab |
| α-SMA (1A4) | Sigma | C6198 | Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-11012 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG | Thermo Scientific | A-11057 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG | Thermo Scientific | A-11036 | Used at 1:500 dilution |
| Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG | Molecular Probes | A-21468 | Used at 1:500 dilution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopes | |||
| Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope | Zeiss | For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT | |
| SZX9 upright dissection stereomicroscope | Olympus | For FT dissection | |
| LSM 780 confocal microscope | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT | |
| AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome | Zeiss | For imaging of whole-mount immunostained FT |
References
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