Summary

原发性人类 CD4+ T 淋巴细胞低线粒体 DNA 污染的 ATAC-seq 检测

Published: March 22, 2019
doi:

Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 以执行检测转座受接触染色质测序 (ATAC-seq) 激活 CD4 + 人类淋巴细胞。该协议已被修改, 以尽量减少污染线粒体 DNA 读取从50% 到3% 通过引入一个新的裂解缓冲液。

Abstract

ATAC-seq 由于其快速简便的方法绘制了全基因组可访问的染色质, 已成为表观遗传学研究中广泛使用的一种方法。在本文中, 我们提出了一个改进的 Ata-seq 协议, 减少污染线粒体 DNA 读取。虽然以前的 Ata-seq 协议与平均50% 的污染线粒体 DNA 的操作作斗争, 但该协议中引入的优化裂解缓冲液将线粒体 DNA 污染降低到平均3%。这种改进的 Ata-seq 协议使测序成本降低了近50%。我们展示了如何从激活的 CD4 + 淋巴细胞制备这些高质量的 Ata-seq 库, 通过数据分析提供 CD4 + 淋巴细胞从全血分离的分步指导。这种改进的 Atc-seq 协议已在广泛的细胞类型中得到验证, 并将立即用于研究染色质可获得性的研究人员。

Introduction

经骨可接触染色质测序 (ATAC-seq) 的检测已迅速成为询问染色质结构的主要方法。ATAC-seq 可以通过标记过程 (用相同的酶对 DNA 进行碎片化和标记) 来识别可访问染色质的区域, 从而生成可测序可以确定整个基因组中可获得染色质的文库。这个标记过程是介导的多活性 Tn5 转座酶, 这只削减开放区域的染色质由于核细胞组位位阻滞。在切割时, tn5 转座酶还插入测序适配器, 通过 pcr 和下一代全基因组可访问染色质 1,2 的测序构建。

ATAC-seq 已成为确定染色质可访问性区域的首选方法, 因为协议相对简单、快速, 质量和信息范围可根据其结果确定, 而且所需的起始材料数量较少。与 DNase-seq3 (也测量全基因组染色质的可及性) 相比, DNase-seq4 (它确定了开放基因组区域中的核糖体位置) 和甲醛介导的 faire-seq5, atac-seq 更快,更便宜, 更可重现性1。它也比较敏感, 与仅有500个原子核的起始材料一起工作, 而 DNase-seq3所需的核为 5, 000万核。与其他方法相比, Atc-seq 还能够提供更多有关染色质结构的信息, 包括转录因子结合、核糖体定位和开放染色质区域1。有效的单细胞 atc-seq 协议已经得到验证, 提供了关于单细胞级别6,7的染色质结构的信息。

Ata-seq 已被用于描述染色质结构的范围广泛的研究和细胞类型, 包括植物8, 人类9, 和许多其他生物。它在确定疾病状态表观遗传调控方面也至关重要。然而, 最广泛使用的 Ata-seq 协议包括从线粒体 DNA 读取污染测序的主要缺点。在某些数据集中, 此污染水平可能高达测序结果1的60%。在这一领域作出了协调一致的努力, 以减少这些污染的线粒体读数, 从而能够更有效地应用 ata-seq 71011.在这里, 我们提出了一个改进的 Ata-seq 协议, 将线粒体 DNA 污染率降低到只有 3%, 允许减少约50% 的测序成本 10。这是通过简化的 CD4 + 淋巴细胞分离和活化过程以及改进的裂解缓冲液实现的, 这对于最大限度地减少线粒体 DNA 污染至关重要。

这种增强型 Ata-seq 协议已通过广泛的原代细胞得到验证, 包括人类原代外周血单个核细胞 (Pbmc) 10、人原代单核细胞和小鼠树突状细胞 (未发表)。它还被成功地用于在非编码元素11的聚集定期间隔短回文重复 (CRISPR) 屏幕中询问黑色素瘤细胞。此外, 本协议中描述并在 GitHub 上提供的数据分析包为新的、有经验的研究人员提供了分析 Ata-seq 数据的工具。ATAC-seq 是在整个基因组中绘制染色质可访问性的最有效的检测方法, 对此处介绍的现有协议进行修改将使研究人员能够生成具有低线粒体 DNA 污染的高质量数据,降低测序成本, 提高 Ata-seq 吞吐量。

Protocol

这一改进的协议为执行 CD4 + 淋巴细胞的 Ata-seq 提供了分步指导, 从全血的起始材料到数据分析 (图 1)。 1. 全血 CD4+ T 细胞的分离 请注意:该方案的起始材料为15毫升的新鲜全血, 使用标准程序收集, 允许根据研究要求选择起始材料的来源。根据需要扩展协议。预热磷酸盐缓冲盐水 (PBS) + 2% 胎儿小牛血清 (FCS) 至室温 (RT), 并在?…

Representative Results

从15毫升的新鲜全血, 该协议产生平均 100万个 CD4 + T 细胞。这些可以冻结以后处理或立即使用。CD4+ T 细胞的活力, 新鲜或解冻, 持续 & gt;95。这种 CD4+ T 细胞分离方法允许在源材料和收集时间方面具有灵活性。这种改进的 Ata-seq 协议生成了一个大于 1 ngμl 的最终库, 用于测序。使用市售系统进行的质量控制应显示200至 1, 000 bp 之间的 DNA 片段 (图 2)。只能…

Discussion

本文介绍的改进的 ATAC-seq 协议提供了可重复的结果, 线粒体 DNA 污染最小。该方案已被用来成功地表征人类原代 Pbmc10、人单核细胞、小鼠树突状细胞 (未发表) 和培养的黑色素瘤细胞系 11的染色质结构。我们预计, 这种改善的裂解条件也有可能适用于其他细胞类型。预计该核分离协议将与单个核 Ata-seq 协议兼容, 最大限度地减少线粒体 DNA 污染, 以改进测序结果。<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢 Atsede Siba 的技术支持。c. s. c. 得到国家卫生研究院拨款1R6DA047032 的支持。

Materials

1X PBS, Sterile Gibco 10010023 Can use other comparable products.
5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets Eppendorf 22625501 Can use other comparable products.
96 Well Round Bottom Plate Thermo Scientific 163320 Can use other comparable products.
Agilent 4200 Tape Station System Agilent G2991AA Suggested for quality assessment.
Cryotubes Thermo Scientific 374081 Can use other comparable products.
DMSO Sigma D8418 Can use other comparable products.
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 Invitrogen Life Technologies 11131D Critical Component
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit Invitrogen Life Technologies 11346D Critical Component
Dynamagnet Invitrogen Life Technologies 12321D Critical Component
FCS Gemini Bio Products 100-500 Can use other comparable products.
High Sensitivity DNA Kit Agilent 50674626 Suggested for quality assessment.
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade Sigma M2393 Can use other comparable products.
MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) Qiagen 28004 Critical Component
Mr. Frosty Thermo Scientific 5100-0001 Can use other comparable products.
NaCl, Molecular Biology Grade Sigma S3014 Can use other comparable products.
NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix New England BioLabs M0541 Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme) Illumina FC1211030 Critical Component
Nuclease Free Sterile dH20 Gibco 10977015 Can use other comparable products.
Polysorbate 20 (Tween20) Sigma P9416 Can use other comparable products.
PowerUp SYBR Green Master Mix Applied Biosystems A25780 Critical Component
Precision Water Bath Thermo Scientific TSGP02 Can use other comparable products.
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 Critical Component
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Life Technologies Q32851 Suggested for quality assessment.
Qubit FlouroMeter Invitrogen Life Technologies Q33226 Suggested for quality assessment.
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium Stem Cell Technologies 15705 Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail Stem Cell Technologies 15022 Critical Component
RPMI-1640 Gibco 11875093 Can use other comparable products.
Sterile Resevoir Thermo Scientific 8096-11 Can use other comparable products.
T100 Thermocycler with Heated Lid BioRad 1861096 Can use other comparable products.
Tris-HCL Sigma T5941 Can use other comparable products.

References

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Cite This Article
Rickner, H. D., Niu, S., Cheng, C. S. ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (145), e59120, doi:10.3791/59120 (2019).

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