Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een test voor transposase-toegankelijk chromatine sequencing (ATAC-seq) op de geactiveerde CD4 + menselijke lymfocyten. Het protocol is aangepast om het minimaliseren van verontreiniging van het mitochondriaal DNA leest van 50% tot 3% via de invoering van een nieuwe lysis-buffermengsel.
ATAC-seq is uitgegroeid tot een veel gebruikte methodiek in de studie van de epigenetica vanwege zijn snelle en eenvoudige benadering van genoom-brede toegankelijk chromatine in kaart te brengen. In deze paper presenteren we een verbeterde ATAC-seq-protocol, dat vermindert de verontreiniging van het mitochondriaal DNA leest. Terwijl vorige ATAC-seq protocollen hebben geworsteld met leest een gemiddelde van 50% besmetten mitochondriaal DNA, de geoptimaliseerde lysis-buffermengsel in dit protocol opgenomen vermindert mitochondriaal DNA besmetting tot een gemiddelde van 3%. Dit verbeterde ATAC-seq-protocol voorziet in een in de omgeving van 50% vermindering van de kosten van het rangschikken. We laten zien hoe deze kwalitatief hoogwaardige ATAC-seq bibliotheken kunnen bereid worden uit geactiveerde CD4 +-lymfocyten, stapsgewijze instructies uit CD4 + lymfocyt isolement van volbloed door middel van data-analyse. Dit verbeterde ATAC-seq-protocol in een breed scala van celtypes is gevalideerd en zullen voor onmiddellijk gebruik aan onderzoekers bestuderen van chromatine toegankelijkheid.
De assay voor transposase-toegankelijk chromatine sequencing (ATAC-seq) is snel uitgegroeid tot de toonaangevende methode voor de raadpleging van de chromatine het platform. ATAC-seq herkent regio’s van de toegankelijke chromatine door het proces van tagmentation, fragmenteren en tagging van DNA door het zelfde enzym, voor de productie van bibliotheken waarmee reeksnummers chromatine toegankelijkheid over een gehele genoom kunt bepalen. Dit tagmentation proces wordt gemedieerd door de hyperactieve Tn5 transposase, die alleen open regio’s van de chromatine als gevolg van nucleosomic sterische hinder snijdt. Als het snijdt, voegt de transposase van de Tn5 ook sequencing adapters waarmee voor snelle bibliotheek bouw door PCR en volgende-generatie sequentiebepaling van het genoom-brede toegankelijk chromatine1,2.
ATAC-seq is uitgegroeid tot de geprefereerde methode om te bepalen van de regio’s van de chromatine toegankelijkheid als gevolg van de relatief eenvoudige en snelle protocol, de kwaliteit en de hoeveelheid informatie die kan worden bepaald uit de resultaten, en de kleine hoeveelheid grondstof nodig. Vergeleken met DNase-seq3 (die ook maatregelen genoom-brede chromatine toegankelijkheid), MNase-seq4 (die bepaalt nucleosoom posities open genoom regio), en de formaldehyde-gemedieerde FAIRE-seq5, ATAC-seq is sneller, goedkoper en meer reproduceerbare1. Het is ook meer gevoelig, werken met de grondstof voor zo weinig als 500 kernen, ten opzichte van de kernen van de 50 miljoen nodig voor DNase-seq3. ATAC-seq heeft ook de mogelijkheid om meer informatie over de architectuur van de chromatine dan andere methoden, met inbegrip van de regio’s van transcriptie factor bindende, nucleosoom positionering en open chromatine regio’s1. Effectieve, eencellige ATAC-seq-protocollen zijn gevalideerd, voorlichting over chromatine architectuur aan de eencellige niveau6,–7.
ATAC-seq is gebruikt voor het karakteriseren van chromatine het platform over een breed spectrum van onderzoek en cellen soorten, met inbegrip van planten8, mens9en vele andere organismen. Het is ook cruciaal voor het identificeren van Epigenetische regulatie van de ziekte staten7geweest. Het meest gebruikte ATAC-seq-protocol bevat echter het grote nadeel van besmetting sequencing leesbewerkingen van mitochondriaal DNA. In sommige datasets kunnen dit niveau van verontreiniging oplopen tot 60% van de volgorde van de resultaten1. Er is een gezamenlijke inspanning op het gebied om deze contaminerende mitochondriale leest zodat de meer efficiënte toepassing van ATAC-seq7,10,11. Hier presenteren we een verbeterde ATAC-seq-protocol dat het mitochondriaal DNA verontreiniging tarief reduceert tot slechts 3%, waardoor vermindering van ongeveer 50% in sequencing kosten10. Dit wordt mogelijk gemaakt door een gestroomlijnd proces van activering, CD4 +-lymfocyten isolatie en een verbeterde lysis-buffermengsel die van essentieel belang bij het minimaliseren van mitochondriaal DNA besmetting.
Dit protocol modifiedATAC-seq is gevalideerd met een breed scala van primaire cellen, met inbegrip van de primaire perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs)10, menselijke primaire monocyten en muis dendritische cellen (niet uitgegeven). Het is ook gebruikt met succes om te ondervragen melanoom cellijnen in een geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) scherm met niet-coderende elementen11. Daarnaast biedt het gegevenspakket analyse in dit protocol omschreven en aangeboden op GitHub nieuwe en ervaren onderzoekers met tools om ATAC-seq gegevens te analyseren. ATAC-seq is de meest effectieve assay chromatine toegankelijkheid over een gehele genoom in kaart, en wijzigingen in het bestaande protocol die hier worden geïntroduceerd onderzoekers om kwalitatief hoogwaardige gegevens met lage mitochondriaal DNA besmetting, te produceren zal toestaan sequencing kostenverlaging en het verbeteren van ATAC-seq doorvoer.
Het gewijzigde ATAC-seq-protocol gepresenteerd in dit artikel biedt reproduceerbare resultaten met minimale mitochondriaal DNA-besmetting. Het protocol is met succes gebruikt om zijn karakteriseren chromatine architectuur van menselijke primaire PBMCs10, menselijke monocyten, muis dendritische cellen (ongepubliceerd), en gekweekte melanoom cel lijnen11. Wij verwachten dat deze verbeterde lysis voorwaarde heeft het potentieel om te werken voor andere celtypes ook. Verwacht w…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Atsede Siba voor technische ondersteuning. CSC wordt ondersteund door de NIH grant 1R61DA047032.
1X PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |