主なヒト cd4 陽性 T リンパ球から低ミトコンドリア DNA 汚染 ATAC seq 試金

Summary

ここでは、活性化 cd4 人間リンパ球を (ATAC seq) をシーケンス処理トランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイを実行するプロトコルを提案します。プロトコルは、新しい換散バッファーの導入により 3% に 50% からミトコンドリア DNA の読み取りの汚染を最小限に変更されています。

Abstract

ATAC seq ゲノムワイド アクセス クロマチンのマッピングへの迅速かつ簡単なアプローチによるエピジェネティクスの研究で広く使われている方法論となっています。本稿ではミトコンドリア DNA の読み取りを汚染を減らす向上の ATAC seq プロトコルを提案する.以前の ATAC seq プロトコルに苦労している間ミトコンドリア DNA の汚染 50% の平均を読み取ると、この議定書で導入された最適化された換散バッファー 3% の平均にミトコンドリア DNA の汚染を軽減します。この改良の ATAC seq プロトコルは、シーケンシング コストに近い 50% 削減できます。データの分析を通じて全血からの cd 4 + リンパ球の隔離からのステップバイ ステップの手順を提供する活性化 cd4 リンパ球からこれらの高品質の ATAC seq ライブラリを準備できる方法を紹介します。改良されたこの ATAC seq プロトコルは細胞のタイプの広い範囲で検証されている、クロマチン接近性を勉強して研究者にすぐに使用されます。

Introduction

トランスポザーゼ アクセス クロマチン (ATAC seq) をシーケンス用急速にクロマチン アーキテクチャを尋問のため主要な方法となっています。ATAC seq は tagmentation、断片化、シーケンスが全ゲノムにわたってクロマチン アクセシビリティを判断できますライブラリを生成する、同じ酵素によって DNA のタグ付けのプロセスを介してアクセス可能なクロマチン領域を識別できます。この tagmentation プロセスは、のみ nucleosomic 立体障害によるクロマチンの開いている領域をカット非常に活発の Tn5 トランスポサーゼによって媒介されます。それはカット、Tn5 トランスポザーゼはまたを可能にする PCR による迅速なライブラリ構築およびゲノムワイド アクセス クロマチン^1,2次世代シーケンス シーケンス アダプターを挿入します。

ATAC seq クロマチン アクセシビリティ比較的単純で高速なプロトコル、品質とその結果、および開始に必要な材料の少量から判断できる情報の範囲のための領域を特定する最寄りの方法となっています。MNase seq⁴ (オープン ゲノム領域のヌクレオソームの位置が決まります)、(これはまたゲノム クロマチン接近性を測定) DNase seq³と比較して、ホルムアルデヒドを介した FAIRE seq⁵、ATAC seq はより速く、安く、そして再現性¹。また、出発の数として DNase seq³に必要な 5000 万の核と比較して 500 の核物質の使用より敏感です。ATAC seq クロマチン アーキテクチャの詳細については、転写因子結合、ヌクレオソームの配置、クロマチン領域¹の地域を含む他の方法よりもを提供することがあります。効果的な単一セルの ATAC seq プロトコルが検証されて、単一細胞レベル^6,7クロマチン アーキテクチャに関する情報の提供します。

ATAC seq はクロマチン アーキテクチャを特徴づける植物⁸人間⁹、および他の多くの有機体を含む研究と細胞のタイプの広い範囲にわたって使用されています。また病気状態⁷のエピジェネティック制御を識別するに重要だった。しかし、最も広く使用されている ATAC seq プロトコルには、ミトコンドリア DNA から汚染シーケンス読み込みの主な欠点が含まれています。一部のデータ セットでこの汚染レベルは配列結果¹の 60% と高いすることができます。ATAC seq^7,10,11のより効率的なアプリケーションを可能にするためにこれらの汚染のミトコンドリアの読み取りを削減するフィールドに協調された努力があります。ご紹介わずか 3% にミトコンドリアの DNA 混入率を減らす向上の ATAC seq プロトコル シーケンス コスト¹⁰で約 50% の削減をできるようにします。これはミトコンドリアの DNA 汚染を最小限に抑える重要な改善の換散バッファーと活性化 cd 4 + リンパ球の隔離の合理化されたプロセスによって可能です。

この modifiedATAC seq プロトコルは、初代培養細胞、ひとの主な末梢血単核球 (PBMCs)¹⁰、人間の主要な球 (未発表) マウス樹状細胞などの広い範囲で検証されています。要素の非コード¹¹クラスター化定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) 画面の悪性黒色腫細胞を尋問する正常にそれ使用されているも。さらに、このプロトコルで記述されている、GitHub 上で提供されるデータ分析パッケージは、ATAC seq データを分析するツールと新しいと経験豊富な研究者を提供します。ATAC seq クロマチン接近性を全体のゲノム全体マップに最も効果的な試金、ここで紹介されている既存のプロトコルに変更になります低のミトコンドリア DNA 汚染と高品質なデータを生成する研究者シーケンス処理のコストを削減し、ATAC seq のスループットの向上します。

Protocol

この改良されたプロトコルは、データ解析 (図 1) による全血の原料から cd4 陽性リンパ球の ATAC seq を実行するための手順を説明します。 1. 全血からの cd 4 + T 細胞の分離 注:このプロトコルのための開始材料は研究の要件に基づいて選択する開始材料の源の標準手続きを使用して収集した新鮮な全血の 15 mL です。必要…

Representative Results

新鮮な全血の 15 mL からは、このプロトコルは 100 万の cd4 陽性 T 細胞の平均を生成します。これらは、後で処理するため冷凍またはすぐに使用できます。新鮮なまたは解凍、cd 4 + T 細胞の生存率は一貫して > 95%。Cd4 陽性 T 細胞分離のこの方法は、柔軟性、ソースの材料とコレクションの時間この改良の ATAC seq プロトコル シーケンスの 1 ng/μ L を超える最後のライブラ…

Discussion

この記事で紹介した修正の ATAC seq プロトコルは、最小限のミトコンドリア DNA 汚染で再現性のある結果を提供します。人間プライマリ PBMCs¹⁰、ひと単球 (未発表) マウス樹状細胞のクロマチン アーキテクチャの特性し、培養メラノーマ細胞線¹¹正常にプロトコルが使用されています。この改良の換散を見込んで条件他のセルタイプのために働く可能性があり?…

Materials

1X PBS, Sterile	Gibco	10010023	Can use other comparable products.
5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets	Eppendorf	22625501	Can use other comparable products.
96 Well Round Bottom Plate	Thermo Scientific	163320	Can use other comparable products.
Agilent 4200 Tape Station System	Agilent	G2991AA	Suggested for quality assessment.
Cryotubes	Thermo Scientific	374081	Can use other comparable products.
DMSO	Sigma	D8418	Can use other comparable products.
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Invitrogen Life Technologies	11131D	Critical Component
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	Invitrogen Life Technologies	11346D	Critical Component
Dynamagnet	Invitrogen Life Technologies	12321D	Critical Component
FCS	Gemini Bio Products	100-500	Can use other comparable products.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	50674626	Suggested for quality assessment.
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade	Sigma	M2393	Can use other comparable products.
MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)	Qiagen	28004	Critical Component
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Can use other comparable products.
NaCl, Molecular Biology Grade	Sigma	S3014	Can use other comparable products.
NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541	Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)	Illumina	FC1211030	Critical Component
Nuclease Free Sterile dH20	Gibco	10977015	Can use other comparable products.
Polysorbate 20 (Tween20)	Sigma	P9416	Can use other comparable products.
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780	Critical Component
Precision Water Bath	Thermo Scientific	TSGP02	Can use other comparable products.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	Critical Component
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen Life Technologies	Q32851	Suggested for quality assessment.
Qubit FlouroMeter	Invitrogen Life Technologies	Q33226	Suggested for quality assessment.
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium	Stem Cell Technologies	15705	Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail	Stem Cell Technologies	15022	Critical Component
RPMI-1640	Gibco	11875093	Can use other comparable products.
Sterile Resevoir	Thermo Scientific	8096-11	Can use other comparable products.
T100 Thermocycler with Heated Lid	BioRad	1861096	Can use other comparable products.
Tris-HCL	Sigma	T5941	Can use other comparable products.