여기, 우리는 transposase 액세스할 수 chromatin (ATAC-seq) 활성화 된 CD4 + 인간 림프 톨에 시퀀싱에 대 한 분석 결과 수행 하는 프로토콜을 제시. 프로토콜은 새로운 세포의 용 해 버퍼의 도입을 통해 3%로 50%에서 미토 콘 드리 아 DNA 읽기 오염 최소화 하기 위해 수정 되었습니다.
ATAC seq 신속 하 고 간단한 접근 방식 게놈 넓은 접근 chromatin 매핑 때문에 epigenetics의 연구에 널리 사용 되는 방법론 되고있다. 이 문서에서 우리는 미토 콘 드리 아 DNA 읽기 오염 감소 하는 향상 된 ATAC seq 프로토콜 제시. 이 프로토콜에 최적화 된 세포의 용 해 버퍼 감소 3%의 평균에 미토 콘 드리 아 DNA 오염 이전 ATAC seq 프로토콜 분투 하는 동안 50% 오염 미토 콘 드리 아 DNA의 평균이 읽습니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 비용에 가까운 50% 감소를 허용 한다. 시연 어떻게이 높은-품질 ATAC seq 라이브러리 활성화 된 CD4 + 세포에서 준비 될 수 있다 데이터 분석을 통해 전체 혈액에서 CD4 + 림프 구 분리에서 단계별 지침을 제공 합니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 다양 한 셀 형식에에서 검증은 고 chromatin 접근성을 공부 하는 연구원에 즉시 사용 될 것입니다.
Transposase 액세스할 수 chromatin (ATAC-seq)을 시퀀싱에 대 한 분석 결과 빠르게 chromatin 구조 질의 대 한 주요 방법 되고있다. ATAC seq tagmentation, 분할 및 라이브러리는 시퀀싱 전체 게놈에서 chromatin 내게 필요한 옵션 확인 수를 생산 하는 동일한 효소에 의해 DNA의 태그의 과정을 통해 액세스할 수 있는 chromatin의 영역을 식별할 수 있습니다. 이 tagmentation 과정만 인하 nucleosomic 입체 지 장 때문 chromatin의 오픈 지역 활동적인 Tn5 transposase에 의해 중재 됩니다. 그것은 삭감으로 Tn5 transposase를 PCR에 의해 빠른 라이브러리 건설과 게놈 넓은 접근 chromatin1,2의 다음-세대 시퀀싱 시퀀싱 어댑터를 삽입 합니다.
ATAC seq 비교적 간단 하 고 빠른 프로토콜, 품질 및 그 결과, 그리고 시작 물자 필요의 작은 금액에서 결정 될 수 있는 정보의 범위 chromatin 접근성의 영역을 결정 하기 위해 선호 되는 방법 되고있다. 비해 DNase seq3 (는 또한 게놈 넓은 chromatin 접근성), MNase-seq4 (오픈 게놈 지역에 nucleosome 위치 결정), 그리고 포름알데히드 중재 시 키-seq5, ATAC seq 빠릅니다, 저렴 하 고 쉽게 재현 가능한1. 그것은 또한 더 중요 한 시작 물자의 500 핵, DNase seq3에 필요한 50 백만 핵에 비해 몇 가지 작업. ATAC seq는 또한 전사 인자 바인딩, nucleosome 위치, 및 오픈 chromatin 지역1의 영역을 포함 하 여 다른 방법 보다 chromatin 아키텍처에 대 한 자세한 정보를 얻을 수가 있다. 효과적인, 단일 셀 ATAC seq 프로토콜은 유효성이 검증, 단일 셀 레벨6,7chromatin 구조에 정보를 제공.
ATAC seq 식물8, 인간9, 그리고 다른 많은 유기 체를 포함 한 연구와 세포 종류의 넓은 스펙트럼에 걸쳐 chromatin 아키텍처의 특성에 사용 되었습니다. 그것은 또한 질병 상태7의 후 성적인 규칙 식별에 중요 한 되었습니다. 그러나, 가장 널리 사용 되는 ATAC seq 프로토콜 오염 시퀀싱 읽기 미토 콘 드리 아 DNA의 주요 단점은 포함합니다. 일부 데이터 집합에서이 오염 수준 시퀀싱 결과1의 60% 만큼 높을 수 있다. ATAC seq7,,1011의 더 효율적인 응용 프로그램을 허용 하려면 이러한 오염 미토 콘 드 리아 읽기를 줄이기 위해 필드에 공동된 노력이입니다. 여기 우리 현재 3%, 미토 콘 드리 아 DNA 오염 속도 감소 시키는 작업을 처리 하는 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 비용10에서 약 50%의 감소를 허용 합니다. 이것은 CD4 + 림프 구 분리 및 활성화 및 미토 콘 드리 아 DNA 오염 최소화에 중요 한 향상 된 세포의 용 해 버퍼의 유선형된 과정에 의해 이루어집니다.
이 modifiedATAC-seq 프로토콜은 다양 한 인간의 기본 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)10, 인간의 기본 monocytes 그리고 마우스 수지상 세포 (미 발표)을 포함 하 여 기본 셀 유효성이 검증 되었습니다. 그것은 또한 사용 되었습니다 성공적으로 비 코딩 요소11의 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 화면에서 흑색 종 세포 라인이. 또한,이 프로토콜에서 설명 하 고 GitHub에 제공 된 데이터 분석 패키지 제공 새로운 경험과 연구를 도구 ATAC seq 데이터를 분석 합니다. ATAC seq 전체 게놈에서 chromatin 접근성을 매핑하는 데 가장 효과적인 분석 결과 이며 여기에 도입 된 기존 프로토콜에 대 한 수정 연구원 낮은 미토 콘 드리 아 DNA 오염, 높은-품질 데이터를 생성 하면 시퀀싱 비용을 절감 하 고 ATAC seq 처리량을 개선.
이 문서에 제공 된 수정된 ATAC seq 프로토콜 최소한의 미토 콘 드리 아 DNA 오염 재현 가능한 결과를 제공 합니다. 프로토콜이 되었습니다 사용 성공적으로 인간의 기본 PBMCs10, 인간 monocytes, (미 출판), 마우스 수지상 세포의 염색 질 건축 특징 및 교양된 흑색 종 세포 라인11. 우리는이 향상 된 세포 예상 상태 뿐만 아니라 다른 세포 유형 대 일 가능성이 있다. 그것 ?…
The authors have nothing to disclose.
우리는 기술 지원에 대 한 Atsede Siba를 감사합니다. C.S.C.는 NIH 그랜트 1R61DA047032에 의해 지원 됩니다.
1X PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |