ATAC-seq analysen med lav Mitokondrielt DNA forurensning fra primære menneskelige CD4 + T-lymfocytter

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å utføre en analyse for transposase tilgjengelig chromatin sekvensering (ATAC-seq) på aktivert CD4 + menneskelige lymfocytter. Protokollen er endret for å minimere forurensende Mitokondrielt DNA leser fra 50% til 3% gjennom innføring av en ny lyseringsbuffer.

Abstract

ATAC-seq blitt en mye brukt metode i studiet av epigenetics på grunn av sin raske og enkle tilnærming til kartlegging genomet hele tilgjengelig chromatin. I denne artikkelen presenterer vi en forbedret ATAC-seq-protokoll som reduserer forurensende Mitokondrielt DNA leser. Mens tidligere ATAC-seq protokoller har slitt med leser gjennomsnittlig 50% forurensende Mitokondrielt DNA, optimalisert lyseringsbuffer introdusert i denne protokollen reduserer Mitokondrielt DNA forurensning til et gjennomsnitt av 3%. Denne forbedrede ATAC-seq-protokollen tillater en nær 50% reduksjon i sekvensering kostnadene. Vi viser hvordan disse høy kvalitet ATAC-seq biblioteker kan tilberedes fra aktivert CD4 + lymfocytter, trinnvise instruksjoner fra CD4 + lymfocytt isolasjon fra hele blod gjennom dataanalyse. Denne forbedrede ATAC-seq-protokollen er validert i en rekke celletyper og blir umiddelbar bruk for forskere studere chromatin tilgjengelighet.

Introduction

Analysen for transposase tilgjengelig chromatin sekvensering (ATAC-seq) har raskt blitt den ledende metoden for avhør chromatin arkitektur. ATAC-seq kan identifisere områder av tilgjengelig chromatin gjennom tagmentation, fragmentering og merking av DNA av det samme enzymet, å produsere biblioteker som sekvensering kan bestemme chromatin tilgjengelighet på tvers av en hel genom. Denne tagmentation prosessen er formidlet av hyperaktiv Tn5 transposase, som bare skjærer åpne områder av chromatin på grunn av nucleosomic steric hindring. Som skjærer, setter Tn5 transposase også sekvensering adaptere som tillater rask biblioteket bygging av PCR og neste generasjons sekvensering av genomet hele tilgjengelig chromatin^1,2.

ATAC-seq blitt den foretrukne metoden for å bestemme regioner i chromatin tilgjengelighet på grunn av relativt enkel og rask protokollen, kvalitet og utvalg av informasjon som kan fastslås fra resultatene, og lite starter materiale kreves. Forhold til DNase-seq³ (som måler også genomet hele chromatin tilgjengelighet), MNase-seq⁴ (som bestemmer nucleosome posisjoner i åpne genomet områder), og formaldehyd-mediert FAIRE-seq⁵, ATAC-seq er raskere, billigere og mer reproduserbar¹. Det er også mer følsomme, arbeider med å starte materialet i løpet av 500 kjerner, sammenlignet med 50 millioner kjerner kreves for DNase-seq³. ATAC-seq har også muligheten til å gi mer informasjon om chromatin arkitektur enn andre metoder, inkludert områder av transkripsjon faktor bindende, nucleosome plassering og åpne chromatin regioner¹. Effektiv, encellede ATAC-seq protokoller har validert, gir informasjon om chromatin arkitektur på encellede nivå^6,7.

ATAC-seq har blitt brukt til å beskrive chromatin arkitektur over et bredt spekter av forskning og celler typer, inkludert planter⁸, mennesker⁹og mange andre organismer. Det har også vært kritisk identifisere epigenetic regulering av sykdom stater⁷. Men inkluderer den mest brukte ATAC-seq-protokollen den store ulempen av forurensning sekvensering leseoperasjoner fra Mitokondrielt DNA. I noen datasett, kan dette forurensning nivået være så høy som 60% av sekvensering resultater¹. Det er en felles innsats i feltet for å redusere disse forurensende mitokondrie leser for å tillate mer effektiv bruk av ATAC-seq^7,10,11. Her presenterer vi en forbedret ATAC-seq-protokoll som reduserer Mitokondrielt DNA forurensning hastigheten til bare 3%, slik at reduksjon av rundt 50% i sekvensering koster¹⁰. Dette er gjort mulig av en strømlinjeformet prosessen med CD4 + lymfocytt isolasjon og aktivisering og en forbedret lyseringsbuffer som er avgjørende i å minimalisere Mitokondrielt DNA forurensning.

Denne modifiedATAC-seq-protokollen er validert med en rekke primære cellene, inkludert menneskelige primære perifert blod mononukleære celler (PBMCs)¹⁰, menneskelige primære monocytter og mus dendrittiske celler (upublisert). Det er også brukt klarer å avhøre melanom cellelinjer i en gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) skjerm ikke-koding elementer¹¹. I tillegg tilbyr data analyse pakken beskrevet i denne protokollen og gitt på GitHub nye og erfarne forskere med verktøy for å analysere ATAC-seq data. ATAC-seq er den mest effektive analysen tilordne chromatin tilgjengelighet på tvers av en hel genomet, og endringer i eksisterende protokollen som introduseres her vil tillate forskere å produsere høykvalitets data med lav Mitokondrielt DNA forurensning, redusere sekvensering kostnader og forbedre ATAC-seq gjennomstrømming.

Protocol

Denne forbedrede protokollen gir trinnvise instruksjoner for utføring ATAC-seq av CD4 + lymfocytter, fra utgangsmaterialet hele blod gjennom dataanalyse (figur 1). 1. isolering av CD4 + T celler fra fullblod Merk: Den starte materialet for denne protokollen er 15 mL av frisk hele blod samles inn ved hjelp av standard prosedyrer, slik at kilden til utgangsmaterialet velges basert på forskning krav. Skalere protokollen et…

Representative Results

Fra 15 mL frisk fullblod genererer denne protokollen et gjennomsnitt på 1 million CD4 + T celler. Dette kan fryses for senere behandling eller brukes umiddelbart. Levedyktighet av CD4 + T celler, friske eller tinte, var konsekvent > 95%. Denne metoden av CD4 + T cellen aisolering gir fleksibilitet i kilde materiale og samling tid. Denne forbedrede ATAC-seq-protokollen gir et siste bibliotek med større enn 1 ng/µL for sekvenser. Kvalitetskontroll utført ved hjelp av kommersielt tilgjen…

Discussion

Modifisert ATAC-seq protokollen presenteres i denne artikkelen gir reproduserbar resultater med minimal Mitokondrielt DNA forurensning. Protokollen har blitt vant til karakteriserer chromatin arkitektur menneskelige primære PBMCs¹⁰, menneskelige monocytter, musen dendrittiske celler (upublisert) og kultivert melanom cellen linjer¹¹. Vi forventer denne forbedret lysis tilstand har potensial til å arbeide for andre celletyper også. Det er også forventet at denne kjerner i…

Materials

1X PBS, Sterile	Gibco	10010023	Can use other comparable products.
5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets	Eppendorf	22625501	Can use other comparable products.
96 Well Round Bottom Plate	Thermo Scientific	163320	Can use other comparable products.
Agilent 4200 Tape Station System	Agilent	G2991AA	Suggested for quality assessment.
Cryotubes	Thermo Scientific	374081	Can use other comparable products.
DMSO	Sigma	D8418	Can use other comparable products.
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Invitrogen Life Technologies	11131D	Critical Component
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	Invitrogen Life Technologies	11346D	Critical Component
Dynamagnet	Invitrogen Life Technologies	12321D	Critical Component
FCS	Gemini Bio Products	100-500	Can use other comparable products.
High Sensitivity DNA Kit	Agilent	50674626	Suggested for quality assessment.
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade	Sigma	M2393	Can use other comparable products.
MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)	Qiagen	28004	Critical Component
Mr. Frosty	Thermo Scientific	5100-0001	Can use other comparable products.
NaCl, Molecular Biology Grade	Sigma	S3014	Can use other comparable products.
NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix	New England BioLabs	M0541	Critical Component
Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)	Illumina	FC1211030	Critical Component
Nuclease Free Sterile dH20	Gibco	10977015	Can use other comparable products.
Polysorbate 20 (Tween20)	Sigma	P9416	Can use other comparable products.
PowerUp SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A25780	Critical Component
Precision Water Bath	Thermo Scientific	TSGP02	Can use other comparable products.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	Critical Component
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen Life Technologies	Q32851	Suggested for quality assessment.
Qubit FlouroMeter	Invitrogen Life Technologies	Q33226	Suggested for quality assessment.
Rosette Sep Human CD4+ Density Medium	Stem Cell Technologies	15705	Critical Component
Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail	Stem Cell Technologies	15022	Critical Component
RPMI-1640	Gibco	11875093	Can use other comparable products.
Sterile Resevoir	Thermo Scientific	8096-11	Can use other comparable products.
T100 Thermocycler with Heated Lid	BioRad	1861096	Can use other comparable products.
Tris-HCL	Sigma	T5941	Can use other comparable products.