الفحص سيديروفوري الفائق من العينات البيئية: زراعة الأنسجة، والتربة السائبة، وتربة Rhizosphere
Summary
نقدم بروتوكول للفحص السريع للعينات البيئية لإمكانات سيديروفوري المساهمة في التوافر البيولوجي المغذيات الدقيقة ودوران في النظم الأرضية.
Abstract
Siderophores (الوزن الجزيئي المنخفض خالب مركبات معدنية) ذات أهمية في ظاهرة إيكولوجية مختلفة تتراوح من الحديد (Fe) البيوجيوكيميائيه الدراجات في التربة، والممرض المنافسة وتشجيع نمو النبات، وإشارة الصليب-المملكة. وعلاوة على ذلك، سيديروفوريس أيضا ذات الأهمية التجارية في التصفية الحية وبيووياثيرينج للمعادن وخامات المعادن. وسيلة سريعة وفعالة من حيث التكلفة، وقوية لتقييم كمية الإنتاج سيديروفوري في العينات المعقدة هي المفتاح للتعرف على جوانب هامة من تداعيات بيئية النشاط سيديروفوري، بما في ذلك، رواية سيديروفوري المنتجة للميكروبات. تم تطوير الطريقة المعروضة هنا لتقييم نشاط سيديروفوري المجتمعات المحلية ميكروبيومي ببراعة، في عينات بيئية، مثل الأنسجة النباتية أو التربة. تجانس العينات وتضعف في متوسط M9 معدلة (بدون الحديد)، وإثراء الثقافات كان المحتضنة لمدة 3 أيام. تم تقييم الإنتاج سيديروفوري في عينات في 24 و 48 و 72 ساعة (ح) استخدام ميكروسكوبية 96-جيدا رواية CAS (خماسي أزورول كروم)-Fe أجار المقايسة، وتكييف أسلوب قياس الألوان تقليديا شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً لتقييم سيديروفوري نشاط، يقوم على الفردية المعزولة الميكروبية المزروعة. قمنا بتطبيق أسلوب لدينا إلى 4 الأنماط الجينية/خطوط مختلفة من القمح (قمح aestivum L.)، بما في ذلك لوجين مادسن، و PI561725 و PI561727 عادة تزرع في شمال غرب المحيط الهادئ الداخلية. إنتاج سيديروفوري تأثرت وضوح النمط الوراثي للقمح، وفي أنواع معينة من الأنسجة النباتية ولاحظ. أننا استخدمت بنجاح أسلوبنا لسرعة الشاشة لتأثير الوراثي النباتي في إنتاج سيديروفوري، ومهمة رئيسية في النظم الإيكولوجية الأرضية والمائية. انتجنا replicates تقنية كثيرة، مما أسفر عن اختلافات إحصائية موثوقة جداً في التربة وداخل الأنسجة النباتية. وتبين النتائج الأهم من ذلك، يمكن استخدام الطريقة المقترحة لسرعة فحص الإنتاج سيديروفوري في عينات معقدة بدرجة عالية من الموثوقية، بطريقة تسمح بالمجتمعات المحلية على الحفاظ على للعمل فيما بعد لتحديد الأنواع والجينات الوظيفية.
Introduction
سيديروفوريس هي الجزيئات الحيوية الهامة المعنية أساسا في استخلاب الحديد للتوافر البيولوجي، ولكن مع مجموعة واسعة من الأغراض الإضافية في النظم الإيكولوجية الأرضية والمائية، بدءاً من النصاب الميكروبية الاستشعار، وإشارات إلى الميكروبية النباتية-المضيفين، تعزيز نمو النباتات، والتعاون والمنافسة داخل المجتمعات الميكروبية المعقدة1،2. سيديروفوريس يمكن عموما تصنيف وفقا للمواقع النشطة والسمات الهيكلية، خلق أربعة أنواع أساسية: كاربوكسيلات، هيدروكساماتي، كاتيتشولاتي، ومختلطة الأنواع3،4. العديد من الكائنات الحية الدقيقة قادرون على التغوط أكثر من نوع واحد من سيديروفوري5 وفي المجتمعات المعقدة، وغالبية العظمى من الكائنات biosynthesize مستقبلات غشاء للسماح باستيعاب مجموعة أوسع من، سيديروفوريس1 6. العمل مؤخرا يشير إلى أن سيديروفوريس أهمية خاصة على صعيد المجتمع المحلي، وحتى في الاتصالات بين المملكة ونقل البيوجيوكيميائيه7،،من89،10 ،11.
وقد استخدمت لأكثر من 30 سنة كعامل شيلاتينغ خماسي أزورول كروم (CAS) لربط الحديد (Fe) في مثل هذه طريقة أن إضافة يغاندس (أي، سيديروفوريس) يمكن أن ينتج عن تفكك المجمع CAS-Fe، وخلق تغيير لون يمكن تحديدها بسهولة في الأجلين المتوسط 12-CAS عندما يرتبط مع الحديد، والصبغ يظهر بلون أزرق ملكي، وكما تنأى بالمجمع CAS-Fe، المتوسط يتغير لونها وفقا لنوع يجند المستخدمة لمسح الحديد13. تم تعديل المتوسطة الأولية المستندة إلى سائل، أنشأ شوين نيلاندس في عام 1987، في العديد من الطرق لاستيعاب تغيير الأهداف الميكروبية14، ونمو العادات والقيود15، فضلا عن مجموعة متنوعة من المعادن بالإضافة إلى الحديد، بما في ذلك الألومنيوم، والمنغنيز، الكوبالت والنيكل كادميوم، الليثيوم، والزنك16، النحاس17و الزرنيخ حتى18.
العديد من مسببات الأمراض البشرية وكذلك كالنباتات الكائنات المجهرية تعزيز النمو (بجبم) قد حددت كالكائنات الحية المنتجة سيديروفوري3،،من1920، وهامة رهيزوسفيري وبجبم اندوفيتيك في كثير من الأحيان اختبار إيجابية بالنسبة لإنتاج سيديروفوري4. الأسلوب السائلة التقليدية المستندة إلى Fe تم تكييف لاختبار microtiter يعزل في زراعة ل إنتاج سيديروفوري21. ومع ذلك، تفشل هذه التقنيات الاعتراف بأهمية المجتمع الميكروبية ككل (ميكروبيومي)، وفي التعاون والتنظيم المحتملة لإنتاج سيديروفوري في التربة والنبات نظم22. ولهذا السبب، قمنا بتطوير بتقييم مستوى المجتمع الفائق لإنتاج سيديروفوري من بيئة معينة، تقوم على المقايسة الأكاديمية التقليدية، ولكن مع النسخ المتماثل، وسهولة قياس، والموثوقية، والتكرار في ميكروسكوبية المقايسة.
في هذه الدراسة، ترد مقايسة CAS-الحديد الفائق، وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن إنتاج سيديروفوري لتقييم تخصيب اليورانيوم لإنتاج سيديروفوري من العينات المعقدة (على أي التربة والنبات هوموجيناتيس الأنسجة). وتم الحصول على تربة rhizosphere السائبة وفضفاضة زمنياً، وربط محكم (من حيث كيفية ملزمة التربة إلى الجذر) جنبا إلى جنب مع الحبوب وتبادل لإطلاق النار، وأنسجة الجذر من الأنماط الجينية القمح متميزة (قمح aestivum L.) أربعة: ليوجاين، مادسن، PI561725، و PI561727. كان الافتراض بأن الاختلافات الجوهرية في الأنماط الجينية القمح يمكن أن يسفر عن الاختلافات في التعيين والاختيار من سيديروفوري المنتجة للمجتمعات المحلية. أهمية خاصة هو الفرق بين المجتمعات الميكروبية المرتبطة بالخط اسوي PI561725، والتي هي الألومنيوم متسامح نظراً لأنها تمتلك ALMT1 (مالات الألومنيوم المنشط 1 الناقل)، مقارنة مع الألومنيوم حساسية PI561727 اسوي الخط، الذي يملك نموذج استجابة غير الألومنيوم من الجينات، almt1،من2324،،من2526. وكان الهدف الرئيسي لهذه الدراسة لتطوير طريقة بسيطة وسريعة لتقييم كمية الإنتاج سيديروفوري في سيديروفوري إثراء الثقافات أنواع العينة معقدة مع الحفاظ على الثقافات للعمل في المستقبل.
Protocol
Representative Results
Discussion
النتيجة الأولى لهذا العمل هو إنتاج المنهجية الجديدة التي يمكن استخدامها لإثراء سريعاً سيديروفوري المنتجة للميكروبات أثناء قياس كمي سيديروفوري/النشاط الإنتاجي في العينات البيئية. المنهجية التي سريعة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة، والنتائج التي تظهر كيف يمكن استخدامه للكشف عن النشاط سيد?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب نود أن نشكر شابان مجروح للمساعدة في الإجراءات المختبرية، عبدل لي لحصاد القمح الوراثي، ومجلس البحوث في عنب كونكورد الدولة واشنطن، ومركز جامعة واشنطن الدولة “الحفاظ على الزراعة” و الموارد الطبيعية لأغراض بيواج منحة لدعم هذا العمل. تم توفير التمويل الإضافي بوزارة الزراعة/NIFA من خلال مشروع هاتش 1014527.
Materials
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
References
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).
- Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. , (2018).
- Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
- Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- O’Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).
- Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28 (13), (2018).
- Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).
- Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).
- Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).
- Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).
- Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).
- Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
- Desai, A., Archana, G. . Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).
- Dertz, E. A., Raymond, K. N., Que, L., Tolman, W. B. . Comprehensive coordination chemistry II. 8, (2003).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
- Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).
- Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238 (4), 657-668 (2013).
- Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).
- Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).
- Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).
- McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
- Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
