Высок объём Siderophore скрининг от проб окружающей среды: растительных тканей, сыпучих грунтов и ризосфере почвы
Summary
Мы представляем собой протокол для быстрого отбора экологических проб для потенциальных siderophore, способствуя биодоступность микроэлементов и оборот в наземных систем.
Abstract
Siderophores (низкий молекулярный вес металла хелатными соединениями) имеют важное значение в различные экологические явления, начиная от железа (Fe) биогеохимических циклов в почвах, возбудитель конкуренции, стимулирования роста растений, и кросс Королевство сигнализации. Кроме того siderophores также имеют коммерческий интерес в биологическое выщелачивание и bioweathering минералов и руд металлов подшипника. Быстрое, экономически эффективные и надежные средства количественной оценки производства siderophore в сложных образцов является ключом к выявлению важных аспектов экологических последствий siderophore деятельности, в том числе, Роман siderophore, производства микробов. Представленные здесь метод был разработан для оценки деятельности siderophore в такт микрофлора сообществ, в пробах окружающей среды, таких как почвы или растения тканей. Образцы были гомогенизированные разводят в изменение средних M9 (без Fe), и обогащения культур были инкубировали в течение 3 дней. Siderophore производство оценивалась в пробах на 24, 48 и 72 часов (h) использование Роман 96-луночных микропланшетов CAS (хром azurol сульфонатных)-Fe агар пробирного, адаптация традиционно утомительным и трудоемким колориметрический метод оценки siderophore деятельность, на индивидуальных возделываемых микробной изолятов. Мы обратились в наш метод для 4 различных генотипов/линий пшеницы (Triticum aestivum L.), включая Lewjain, Мадсен и PI561725 и PI561727, обычно выращивается внутреннему Тихоокеанском северо-западе. Siderophore производство четко затронуты генотипов пшеницы и в конкретных видах тканей растений наблюдается. Мы успешно использовали наш метод для быстро экран для влияния генотип растений на siderophore производстве, одной из ключевых функций в наземных и водных экосистем. Мы произвели много технических реплицирует, уступая очень надежные статистические различия в почвах и в тканях растений. Важно отметить, что результаты показывают, что предложенный метод может использоваться для быстро изучить производство siderophore в сложных образцов с высокой степенью надежности, в манере, которая позволяет общинам необходимо сохранить для дальнейшей работы для определения таксонов и функциональных генов.
Introduction
Siderophores являются важными биомолекул участвует главным образом в железо Хелаты для биодоступность, но с широкий спектр дополнительных целей в наземных и водных экосистем, начиная от микроорганизмов кворума зондирования, сигнализации для микробной растений хозяев, стимулирования роста растений, сотрудничества и конкуренции в рамках сложных микробных сообществ1,2. Siderophores можно подразделить по их активных сайтов и структурных особенностей, создание четырех основных типов: карбоксилат, hydroxamate, catecholate и смешанные типы3,4. Многие микроорганизмы способны выделяют более чем один тип siderophore5 и в сложных общинах, подавляющее большинство организмов biosynthesize мембранных рецепторов разрешить поглощение даже широкий спектр siderophores1, 6. Недавние работы показывает, что siderophores имеют особенно важное значение на уровне общин и даже в коммуникации между Королевством и биогеохимических переводы7,8,9,10 ,11.
Хром azurol сульфонатных (CAS) был использован для более чем 30 лет в качестве агента хелатирующих для связывания железа (Fe) таким образом, что добавление лигандов (т.е. siderophores) может привести к диссоциации CAS-Fe комплекса, создавая изменения легко идентифицировать цвета в среднесрочной 12. когда CAS связан с Fe, краситель появляется как Королевский синий цвет, и как комплекс CAS-Fe разъединяет, средний меняет цвет в зависимости от типа лигандов для Мусоробот Fe-13. Первоначальный, на основе жидкости среднего, установленные Schwyn и Нейлэндс в 1987 году, был изменен в много способов, чтобы вместить изменения микробной цели14, роста привычки и ограничения15, а также различных металлов, кроме Fe, включая алюминия, марганца, кобальта, кадмий никель, литий, цинка16, медные17и даже мышьяк18.
Многие патогенов человека, а также как посадить роста развитие микроорганизмов (PGPM) были определены как siderophore производителей организмов3,19,20и важные ризосфере и эндофитные PGPM часто тест siderophore производство4положительный. Традиционный метод жидкость на основе Fe был адаптирован к микротитровальных тестирования изолятов культивирования для производства siderophore21. Однако эти методы не признать важность микробных в целом (микрофлора), в сотрудничестве и потенциал регулирования производства siderophore в почве и растений систем22. По этой причине мы разработали общинного уровня оценки высок объём производства siderophore из определенной среды, основанные на традиционной assay CAS, но с репликации, простота измерения, надежность и воспроизводимость в микропланшетов анализа.
В этом исследовании экономически эффективных, высокопроизводительных assay CAS-Fe для обнаружения siderophore производства представлен для оценки обогащения siderophore производства из сложных образцов (то есть, гомогенатах ткани почвы и растений). Массовая, слабо связанные и плотно прыгните ризосфере почвы (с точки зрения как почвы был привязан к корню) были получены вместе с зерном, стрелять и тканей корня из четырех генотипов собственный пшеницы (Triticum aestivum L.): Lewjain, Мадсен, PI561725, и PI561727. Было предположить, что фундаментальные различия в генотипов пшеницы может привести к различиям в подбор siderophore, производства общин. Особый интерес это различие между микробных сообществ, связанной с линией isogenic PI561725, который является алюминий терпимая(ый), потому что он обладает ALMT1 (алюминий активированный малат транспортер 1), по сравнению с алюминия чувствительных PI561727 isogenic линия, которая обладает гибкой формы-алюминиевые гена, almt123,24,25,26. Главной задачей этого исследования было разработать простой, быстрый метод количественной оценки производства siderophore в siderophore обогащения культур сложных образцов типов при сохранении культур для будущей работы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основным результатом этой работы является производство новой методологии, которая может использоваться для быстрого обогащения для siderophore производства микробов при количественном измерении siderophore производством в образце окружающей среды. Методология является быстрым, простым и эко?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Kalyani Мухунтхар за помощь в лабораторных процедур, ли Opdahl для уборки пшеницы генотип, винограда Конкорд исследования Вашингтон государственный совет и центр университета штата Вашингтон для поддержания сельского хозяйства и Природные ресурсы для BIOAg Грант для поддержки этой работы. Дополнительное финансирование было предоставлено USDA/НИФА через люк проекта 1014527.
Materials
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
References
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).
- Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. , (2018).
- Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
- Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- O’Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).
- Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28 (13), (2018).
- Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).
- Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).
- Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).
- Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).
- Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).
- Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
- Desai, A., Archana, G. . Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).
- Dertz, E. A., Raymond, K. N., Que, L., Tolman, W. B. . Comprehensive coordination chemistry II. 8, (2003).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
- Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).
- Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238 (4), 657-668 (2013).
- Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).
- Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).
- Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).
- McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
- Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
