Pseudobactina high-throughput Screening de muestras ambientales: los tejidos, a granel suelos y rizosfera de suelos de la planta
Summary
Presentamos un protocolo para la detección rápida de muestras ambientales para pseudobactina potencial contribuyendo a micronutrientes biodisponibilidad y volumen de ventas en sistemas terrestres.
Abstract
Sideróforos (quelantes de compuestos del metal de bajo peso molecular) son importantes en el fenómeno ecológico diversos que van desde ciclo biogeoquímicos hierro (Fe) en los suelos, a la competencia de patógeno, promoción del crecimiento vegetal y Cruz-Reino de señalización. Además, sideróforos son también de interés comercial en biolixiviación y bioweathering de metal-minerales y los minerales. Un medio rápido, eficaz y robusto de evaluar cuantitativamente la producción de pseudobactina en muestras complejas es clave para la identificación de aspectos importantes de las consecuencias ecológicas de pseudobactina actividad, incluyendo, novela pseudobactina producir microbios. El método presentado aquí fue desarrollado para evaluar actividad de pseudobactina de comunidades del microbioma en el tacto, en muestras ambientales, tales como los tejidos de la planta o el suelo. Las muestras fueron homogeneizadas y diluidas en un medio modificado de M9 (sin Fe), y cultivos de enriquecimiento se incubaron por 3 días. Producción de pseudobactina se evaluó en las muestras a las 24, 48 y 72 horas (h) utilizar una microplaca de 96 pozos novela CAS (cromo azurol sulfonato)-ensayo de agar de Fe, una adaptación del método colorimétrico de evaluar pseudobactina tradicionalmente tedioso y lento actividad, el individuo cultiva cepas microbianas. Aplicamos nuestro método a 4 genotipos líneas de trigo (Triticum aestivum L.), incluyendo Lewjain, PI561725, Madsen y PI561727 comúnmente cultivadas en el Pacífico noroeste interior. Producción de pseudobactina fue afectado claramente por el genotipo de trigo y en los tipos específicos de tejidos vegetales observados. Hemos utilizado con éxito nuestro método para detectar rápidamente la influencia del genotipo de la planta en producción de pseudobactina, una función clave en los ecosistemas terrestres y acuáticos. Produjimos muchas repeticiones técnicas, produciendo diferencias estadísticas muy confiables en suelos y en los tejidos vegetales. Lo importante, los resultados muestran que el método propuesto puede utilizarse para examinar rápidamente la producción de pseudobactina en muestras complejas con un alto grado de fiabilidad, de manera que permite a las comunidades a preservarse para que trabajo posterior identificar taxones y genes funcionales.
Introduction
Sideróforos son importantes biomoléculas implicadas principalmente en la quelación del hierro de biodisponibilidad, pero con una amplia gama de propósitos adicionales en ecosistemas terrestres y acuáticos, desde la microbiana quórum sensing, señalización a microbianas-anfitriones de la planta, promoción del crecimiento vegetal, la cooperación y competición dentro de las comunidades microbianas complejas1,2. Sideróforos pueden ampliamente clasificarse según sus sitios activos y características estructurales, creando cuatro tipos básicos: carboxilato, hydroxamate, catecholate y mezclado tipo3,4. Muchos microorganismos son capaces de excretar más de un tipo de pseudobactina5 y en comunidades complejas, una gran mayoría de organismos sintetizar los receptores de membrana para permitir la absorción de una variedad aún más amplia de sideróforos1, 6. Trabajo reciente indica que los sideróforos son particularmente importantes en el nivel de la comunidad e incluso en el Reino entre comunicaciones y transferencias biogeoquímicas7,8,9,10 ,11.
Cromo azurol sulfonato (CAS) se ha utilizado por más de 30 años como un agente quelante para enlazar el hierro (Fe) de tal manera que la adición de ligandos (es decir, sideróforos) puede resultar en la disociación del complejo CAS-Fe, creando un cambio de color fácilmente identificable en el medio 12. cuando el CAS está ligada con la Fe, el tinte aparece como un color azul real, y como se disocia el complejo de CAS-Fe, el medio cambia de color según el tipo de ligando utilizado para compactar la Fe13. El medio inicial, base líquida establecido por Schwyn y Neilands en 1987, se ha modificado de muchas maneras para cambiar microbiana objetivos14, hábitos de crecimiento y limitaciones15, así como una variedad de metales además de Fe, incluyendo aluminio, manganeso, cobalto, níquel cadmio, litio, zinc16, cobre17e incluso arsénico18.
Muchos patógenos humanos, así como microorganismos de promoción de crecimiento (PGPM) han sido identificados como organismos productores de pseudobactina3,19,20y rizosfera importante y endófitos PGPM a menudo prueba positivo para la producción de pseudobactina4. El método líquido basado en la Fe tradicional se ha adaptado para microtitulación pruebas de aislamientos en cultivo para producción de pseudobactina21. Sin embargo, estas técnicas no reconocer la importancia de la comunidad microbiana en su totalidad (microbioma), en cooperación y regulación potencial de pseudobactina producción en suelos y sistemas de planta22. Por esa razón, hemos desarrollado una evaluación de nivel de la comunidad de alto rendimiento de pseudobactina producción de un entorno dado, basado en el análisis tradicional de CAS, pero con replicación, facilidad de medición, fiabilidad y repetibilidad en una microplaca ensayo.
En este estudio, se presenta un análisis de CAS-Fe rentable, de alto rendimiento para la detección de pseudobactina producción para evaluar el enriquecimiento de la producción de pseudobactina de muestras complejas (es decir, suelo y planta de homogenados de tejido). Suelo de la rizosfera a granel, limite y firmemente enlazado (en términos de cómo la tierra estuvo limitada a la raíz) se obtuvieron junto con grano, disparar y los tejidos de la raíz de cuatro genotipos distintos de trigo (Triticum aestivum L.): Lewjain, Madsen, PI561725, y PI561727. Fue presumido que diferencias fundamentales en los genotipos de trigo podrían resultar en diferencias en el reclutamiento y selección de pseudobactina comunidades productoras. De particular interés es la diferencia entre las comunidades microbianas asociadas con la línea isogénicas de PI561725, que es de aluminio tolerante porque posee ALMT1 (aluminio activación malato Transporter 1), en comparación con el aluminio sensible PI561727 isogénicas línea, que posee una forma sensible sin aluminio del gene, almt123,24,25,26. El objetivo principal del estudio fue desarrollar un método sencillo y rápido de evaluar cuantitativamente pseudobactina producción en cultivos de enriquecimiento pseudobactina de tipos de muestras complejas mientras que preserva las culturas para el trabajo futuro.
Protocol
Representative Results
Discussion
El principal resultado de este trabajo es la producción de una nueva metodología que puede utilizarse para enriquecer rápidamente para producir microbios y cuantitativo de medición pseudobactina producción y actividad en la muestra ambiental de pseudobactina. La metodología es rápida, sencilla y rentable, y los resultados muestran cómo puede ser utilizado para detectar actividad de pseudobactina de tipos de muestras complejas y novedosas (por ejemplo., tejido de suelo y planta). El protocolo también da …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Kalyani Muhunthan por asistencia en procedimientos de laboratorio, Lee Opdahl para la cosecha de genotipo de trigo, el Consejo de investigación de Washington estado uva Concord y la Washington State University Center para mantener la agricultura y Concesión de recursos naturales para un BIOAg para apoyar este trabajo. Financiación adicional fue proporcionada por la USDA/NIFA a través del proyecto 1014527 de la portilla.
Materials
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
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