תפוקה גבוהה Siderophore הקרנה מדגימות סביבתי: צמח רקמות תפזורת קרקעות, Rhizosphere קרקעות
Summary
אנו מציגים פרוטוקול להקרנה מהירה של דגימות סביבתי עבור siderophore פוטנציאל לתרום הזמינות הביולוגית micronutrient והמסירה במערכות יבשתי.
Abstract
Siderophores (משקל נמוך-מולקולרי מתכת chelating תרכובות) חשובים שונים לתופעה אקולוגית החל ברזל (Fe) biogeochemical על אופניים בקרקעות, תחרות הפתוגן, צמח צמיחה קידום של צלב-ממלכת איתות. יתר על כן, siderophores גם הם עניין מסחרי ב- bioleaching ו- bioweathering של מינרלים, עפרות מתכת-מיסב. אמצעי מהיר, חסכוני וחזק באופן כמותי הערכת ייצור siderophore בדגימות מורכבות היא המפתח לזיהוי היבטים חשובים של ההשלכות האקולוגי של פעילות siderophore, כולל, הרומן siderophore בהפקת חיידקים. השיטה המוצגת כאן פותחה כדי להעריך את הפעילות siderophore של קהילות microbiome בטקט, בדגימות סביבתיים, כגון רקמות אדמה או צמח. הדגימות היו הומוגני, מדולל במדיום M9 ששונתה (ללא Fe), העשרה תרבויות היו הדגירה למשך 3 ימים. Siderophore ההפקה נאמד בדגימות ב 24, 48, 72 שעות (h) באמצעות microplate 96-ובכן הרומן של רשויות אישורים (כרום azurol sulphonate)-Fe אגר assay, עיבוד של השיטה באופן מסורתי מייגע ולגזול ערכי צבע מוחלטים של הערכת siderophore פעילות, המבוצעות על הפרט טיפח מבודד מיקרוביאלי. נוכל להחיל את השיטה שלנו 4 שונים אחרים/שורות של חיטה (חיטת הלחם ל’), כולל Lewjain, מדסן, ו PI561725 ו- PI561727 בדרך כלל גדל בצפון-מערב האוקיינוס השקט היבשה. Siderophore הייצור היה בבירור מושפע של גנוטיפ של חיטה, ובעוד סוגים ספציפיים של רקמות הצמח שנצפו. אנחנו משתמשים בהצלחה השיטה שלנו על המסך במהירות עבור השפעת הצמח גנוטיפ על ייצור siderophore, פונקציה מפתח במערכות אקולוגיות יבשתי ו הימית. שהפקנו משכפל טכניים רבים, מניב אמינים מאוד הבדלים סטטיסטיים בקרקעות ובתוך רקמות הצמח. חשוב לציין, התוצאות מציגות שהשיטה המוצעת ניתן לבחון במהירות siderophore ייצור בדגימות מורכבים עם רמה גבוהה של אמינות, באופן המאפשר קהילות להישמר לעבודה מאוחר יותר לזהות את taxa ואת הגנים פונקציונלי.
Introduction
Siderophores הם בעיקר מעורב ברזל-קלאציה הזמינות הביולוגית, אבל עם מגוון רחב של מטרות נוספות של מערכות אקולוגיות יבשתי ו הימית, החל quorum מיקרוביאלי חישה, איתות צמח חיידקים-המארחים, חשוב מולקולות קידום התפתחות הצמח, שיתוף פעולה ותחרות בתוך קהילות מיקרוביאלי מורכבים1,2. Siderophores יכולים להיות בהרחבה מסווגים לפי אתרים פעילים שלהם תכונות מבניות, יצירת מארבעה סוגים: carboxylate, hydroxamate, catecholate, מעורבבים סוגים3,4. מיקרואורגניזמים רבים מסוגלים מפריש יותר מסוג אחד של siderophore5 , בקהילות מורכבים, הרוב המכריע של אורגניזמים biosynthesize קולטני ממברנה כדי לאפשר את קליטת מגוון רחב אף יותר של siderophores1, 6. עבודה מצביע על כך siderophores הן חשוב במיוחד ברמה הקהילתית, אפילו התקשורת הבין-הממלכה, העברות biogeochemical7,8,9,10 ,11.
Chrome azurol sulphonate (CA) שימש במשך למעלה מ-30 שנה בתור חומר מכלט לקשור על ברזל (Fe) בצורה כזאת, כי תוספת של ליגנדים (קרי: siderophores) יכול לגרום דיסוציאציה במתחם קסטיאל-Fe, יצירת שינוי צבע קלות לזיהוי במדיום 12. כאשר רשויות אישורים מאוגד עם Fe לצבוע מופיע בצבע כחול אדמדם, כפי dissociates המתחם CAS-Fe, המדיום משנה את צבעו בהתאם לסוג של ליגנד להתרגל לנקות את Fe13. המדיום הראשונית, בנוזל נוסדה על ידי Schwyn, Neilands בשנת 1987, שונתה בדרכים רבות כדי להכיל שינוי מטרות מיקרוביאלי14, גדילה הרגלי מגבלות15, וכן מגוון של מתכות חוץ Fe, כולל אלומיניום, מנגן, קובלט, ניקל קדמיום, ליתיום, אבץ16, נחושת17ו אפילו ארסן18.
פתוגנים אנושיים רבים, כמו גם כמו צמח צמיחה קידום מיקרואורגניזמים (PGPM) זוהו אורגניזמים לייצר siderophore3,19,20, ו rhizosphere חשוב PGPM endophytic לעיתים קרובות מבחן חיובית עבור ייצור siderophore4. מבוסס-Fe נוזלי השיטה המסורתית כבר מותאם microtiter בדיקה של מבודד בטיפוח הפקה siderophore21. עם זאת, שיטות אלה אינם מזהים את החשיבות של הקהילה מיקרוביאלי בכללותה (microbiome), בשיתוף ורגולציה פוטנציאל הייצור siderophore קרקעות, צמח מערכות22. לכן, פיתחנו הערכה הקהילה ברמת תפוקה גבוהה של siderophore הפקה של סביבה נתונה, המבוססת על וזמינותו CAS מסורתי, אבל עם שכפול, קלות מדידה, אמינות של הדיר ב- microplate וזמינותו.
במחקר זה, מוצג assay CAS-Fe חסכונית, תפוקה גבוהה לגילוי siderophore הייצור כדי להעריך את העשרת siderophore הייצור מדגימות מורכבים (קרי, אדמת וצמח רקמת homogenates). Rhizosphere בתפזורת, באופן רופף מכורך ו בחוזקה מאוגד-אדמת (מבחינת איך האדמה קשורה השורש) התקבלו יחד עם התבואה, לירות, שורש רקמות ארבעה אחרים ברורים חיטה (חיטת הלחם ל’): Lewjain, מדסן, PI561725, ו PI561727. זה היה שיערו כי יסוד הבדלים אחרים חיטה יכול לגרום הבדלים גיוס ומיון של siderophore בהפקת קהילות. עניין מיוחד הוא ההבדל בין קהילות חיידקים הקשורים עם קו isogenic PI561725, אשר אלומיניום עמיד בפני תקלות כי הוא בעל ALMT1 (מופעל אלומיניום בנויים המשלח 1), בהשוואה עם האלומיניום רגיש PI561727 isogenic קו, אשר ברשותה אלומיניום שאינם מגיבים צורה של הגן, almt123,24,25,26. המטרה הראשית של המחקר הייתה לפתח שיטה פשוטה, מהירה באופן כמותי להעריך הייצור siderophore בתרבויות העשרה siderophore של סוגי מדגם מורכבים תוך שמירה על התרבויות לעבודה עתידית.
Protocol
Representative Results
Discussion
התוצאה העיקרית של עבודה זו הוא הייצור של מתודולוגיה חדשה זה יכול לשמש כדי להעשיר במהירות siderophore בהפקת חיידקים בעוד באופן כמותי מדידת siderophore ייצור/פעילות במדגם סביבתיים. המתודולוגיה היא מהירה, פשוטה וחסכונית, התוצאות מציגות כיצד זה יכול לשמש כדי לזהות פעילות siderophore של סוגי מדגם מורכבים ולא …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות Muhunthan קאליאני לסיוע תהליכי מעבדה, Opdahl לי על חיטה גנוטיפ קציר, המועצה למחקר עינב מדינת וושינגטון ו המרכז האוניברסיטאי של מדינת וושינגטון לחקלאות הסדירה ו משאבים טבעיים עבור BIOAg להעניק תמיכה עבודה זו. מימון נוסף סופק על ידי משרד החקלאות/NIFA דרך פתח פרוייקט 1014527.
Materials
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
References
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).
- Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. , (2018).
- Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
- Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- O’Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).
- Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28 (13), (2018).
- Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).
- Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).
- Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).
- Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).
- Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).
- Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
- Desai, A., Archana, G. . Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).
- Dertz, E. A., Raymond, K. N., Que, L., Tolman, W. B. . Comprehensive coordination chemistry II. 8, (2003).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
- Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).
- Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238 (4), 657-668 (2013).
- Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).
- Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).
- Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).
- McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
- Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
