Sideroforo high-throughput Screening da campioni ambientali: tessuti, Bulk terreni e suoli rizosfera della pianta
Summary
Vi presentiamo un protocollo per lo screening rapido di campioni ambientali per sideroforo potenziale che contribuiscono alla biodisponibilità di micronutrienti e fatturato nei sistemi terrestri.
Abstract
Siderofori (composti di chelatazione metallo di basso peso molecolare) sono importanti in varie fenomeno ecologico che vanno dal ferro (Fe) ciclismo biogeochimici in terreni, a concorrenza di agente patogeno, promozione della crescita di pianta e cross-Unito della segnalazione. Inoltre, siderofori sono anche di interesse commerciale di bioleaching e bioweathering del metallo-cuscinetto minerali e minerali. Un mezzo rapido, conveniente e affidabile di valutare quantitativamente la produzione sideroforo in campioni complessi è la chiave per identificare gli aspetti importanti delle ramificazioni ecologiche di sideroforo attività, tra cui, romanzo sideroforo producendo i microbi. Il metodo qui presentato è stato sviluppato per valutare l’attività di sideroforo delle Comunità in tatto microbiome, in campioni ambientali, quali i tessuti del suolo o delle piante. I campioni sono sono omogeneizzati e diluiti in un mezzo di M9 modificato (senza Fe) e colture di arricchimento sono state incubate per 3 giorni. Produzione di sideroforo è stata valutata nei campioni a 24, 48 e 72 ore (ore) utilizzando una micropiastra a 96 pozzetti CAS (Chrome azurol solfonato) romanzo-saggio agar Fe, un adattamento del metodo colorimetrico tradizionalmente noioso e richiede tempo di valutazione sideroforo attività svolta su singoli isolati microbici coltivati. Abbiamo applicato il nostro metodo a 4 diversi genotipi/linee di grano (Triticum aestivum L.), tra cui Lewjain, Madsen e PI561725 e PI561727 comunemente coltivata nel nord-ovest pacifico dell’entroterra. Sideroforo produzione chiaramente è stata influenzata dal genotipo del grano con i tipi specifici di tessuti vegetali osservati. Abbiamo utilizzato con successo il nostro metodo per selezionare rapidamente per l’influenza del genotipo di pianta il sideroforo produzione, una funzione chiave negli ecosistemi terrestri e acquatici. Abbiamo prodotto molti tecnici replicati, producendo le differenze statistiche molto affidabile nel suolo e all’interno di tessuti vegetali. D’importanza, i risultati mostrano che il metodo proposto può essere utilizzato per esaminare rapidamente sideroforo produzione in campioni complessi con un alto grado di affidabilità, in un modo che permette alle comunità di essere conservato per lavoro successivo identificare taxa e geni funzionali.
Introduction
Siderofori sono importanti biomolecole coinvolte principalmente nella chelazione del ferro per biodisponibilità, ma con una vasta gamma di ulteriori finalità negli ecosistemi terrestri e acquatici che vanno da microbica quorum sensing, segnalazione di microbiche pianta-padroni di casa, Promozione della crescita di pianta, la cooperazione e la concorrenza all’interno di comunità microbiche complesse1,2. Siderofori possono essere classificati secondo la loro siti attivi e caratteristiche strutturali, creazione di quattro tipi di base: carbossilato, idrossammica, catecolati e mescolato tipi3,4. Molti microrganismi sono in grado di espellere più di un tipo di sideroforo5 e in comunità complesse, una vasta maggioranza di organismi biosintetizzare i recettori di membrana per consentire l’assorbimento di una varietà ancora più ampia di siderofori1, 6. Lavoro recente indica che i siderofori sono particolarmente importanti a livello comunitario e anche nelle comunicazioni inter-Unite e biogeochimici trasferimenti7,8,9,10 ,11.
Chrome azurol solfonato (CAS) è stato utilizzato per oltre 30 anni come un agente chelante di legare il ferro (Fe) in modo che aggiunta di ligandi (cioè, siderofori) può provocare la dissociazione del complesso CAS-Fe, creando un cambiamento di colore facilmente identificabile nel medio 12. quando il CAS è associato con Fe, il colorante viene visualizzato come un colore blu royal e come il complesso di CAS-Fe si dissocia, il mezzo cambia colore a seconda del tipo di legante utilizzato per pulire il Fe13. Il mezzo iniziale, base liquida costituito da Schwyn e Neilands nel 1987, è stato modificato in molti modi per ospitare cambiando obiettivi microbica14, abitudini di crescita e limitazioni15, nonché una varietà di metalli oltre a Fe, tra cui alluminio, manganese, cobalto, nichel cadmio, litio, zinco16, rame17e anche arsenico18.
Molti agenti patogeni umani, anche come impianto di microrganismi promuovere crescita (International) sono stati identificati come organismi produttori sideroforo3,19,20e importante rizosfera ed endophytic International spesso prova positivo per sideroforo-produzione4. Il tradizionale metodo di liquido basato su Fe è stato adattato per microtitolazione test degli isolati in coltura per sideroforo produzione21. Tuttavia, queste tecniche non riescono a riconoscere l’importanza della comunità microbica nel suo complesso (il microbioma), in collaborazione ed eventuale regolazione della produzione sideroforo nel suolo e pianta sistemi22. Per questo motivo, abbiamo sviluppato una valutazione di livello comunitario di alto-rendimento di produzione sideroforo da un determinato ambiente, basato sull’analisi CAS tradizionale, ma con replica, facilità di misurazione, affidabilità e ripetibilità in una micropiastra test.
In questo studio, un’analisi di CAS-Fe conveniente, ad alta produttività per la rilevazione di produzione sideroforo è presentata per valutare l’arricchimento della produzione sideroforo da campioni complessi (cioè, del suolo e pianta omogenati). Alla rinfusa, debolmente accoppiate e strettamente associato rizosfera suolo (in termini di come il suolo era legato alla radice) sono stati ottenuti con grano, sparare e tessuti di radice da quattro genotipi distinti frumento (Triticum aestivum L.): Lewjain, Madsen, PI561725, e PI561727. È stato supposto che differenze fondamentali in genotipi di frumento potrebbero comportare differenze nel reclutamento e nella selezione di sideroforo producendo le comunità. Di particolare interesse è la differenza tra comunità microbiche associata alla linea isogeniche di PI561725, che è in alluminio tollerante perché possiede ALMT1 (alluminio-attivato Malate Transporter 1), confrontata con l’alluminio PI561727 isogeniche linea sensitive, che possiede una forma reattiva non-alluminio del gene, almt123,24,25,26. L’obiettivo principale dello studio era di sviluppare un metodo semplice, rapido, di valutare quantitativamente la produzione sideroforo in colture di arricchimento sideroforo di tipi di campioni complessi, preservando le colture per il lavoro futuro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il principale risultato di questo lavoro è la produzione di una nuova metodologia che può essere utilizzata per arricchire rapidamente per sideroforo producendo microbi durante la misurazione quantitativamente sideroforo/attività di produzione del campione ambientale. La metodologia è rapido, semplice e conveniente, e i risultati mostrano come può essere utilizzato per rilevare l’attività di sideroforo da tipi di campioni complessi e romanzo (ad es.., del suolo e pianta del tessuto). Il protocollo inoltre …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Kalyani Muhunthan per assistenza in procedure di laboratorio, Lee Opdahl per la raccolta del grano genotipo, Consiglio di ricerca d’uva dello stato di Washington e la Washington State University Center per sostenere l’agricoltura e Risorse naturali per un BIOAg concedere per sostenere questo lavoro. Finanziamenti supplementari è stato fornito dall’USDA/catino attraverso progetto portello 1014527.
Materials
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
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