पर्यावरण के नमूनों से उच्च प्रवाह Siderophore स्क्रीनिंग: संयंत्र के ऊतकों, थोक मिट्टी, और Rhizosphere मिट्टी
Summary
हम siderophore संभावित सूक्ष्मपोषक जैव उपलब्धता और स्थलीय प्रणालियों में कारोबार के लिए योगदान के लिए पर्यावरणीय नमूनों की तेजी से जांच के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
Siderophores (कम आणविक वजन धातु chelating यौगिकों) लोहे से लेकर विभिंन पारिस्थितिक घटना में महत्वपूर्ण है (Fe) मिट्टी में biogeochemical सायक्लिंग, रोगज़नक़ प्रतियोगिता, संयंत्र विकास संवर्धन, और पार राज्य संकेतन । इसके अलावा, siderophores भी कर रहे है वाणिज्यिक ब्याज में और अधिक के साथ-साथ और अधिक धातु-असर खनिज और अयस्कों का अपक्षय । एक तेजी से, लागत प्रभावी, और मात्रात्मक जटिल नमूनों में siderophore उत्पादन का आकलन के मजबूत साधन siderophore गतिविधि के पारिस्थितिक असर, सहित, उपंयास siderophore उत्पादन रोगाणुओं के महत्वपूर्ण पहलुओं की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां प्रस्तुत विधि में चालबाज microbiome समुदायों की siderophore गतिविधि का आकलन करने के लिए विकसित किया गया था, पर्यावरणीय नमूनों में, जैसे मिट्टी या पौधों के ऊतकों । नमूनों homogenized थे और एक संशोधित M9 मध्यम (Fe के बिना) में पतला, और संवर्धन संस्कृतियों 3 दिनों के लिए मशीन थे । Siderophore उत्पादन में नमूनों में मूल्यांकन किया गया था 24, ४८, और ७२ घंटे (एच) एक उपंयास का उपयोग ९६-अच्छी तरह से microplate कैस (क्रोम azurol sulphonate)-Fe आगर परख, पारंपरिक थकाऊ और समय लेने वाली वर्णमिति विधि के एक अनुकूलन का आकलन Siderophore गतिविधि, व्यक्तिगत खेती माइक्रोबियल अलग पर प्रदर्शन किया । हम गेहूं की 4 अलग पादी/लाइनों (Triticum aestivum एल), Lewjain, Madsen, और PI561725 सहित के लिए हमारे विधि लागू है, और आमतौर पर अंतर्देशीय प्रशांत नॉर्थवेस्ट में हो PI561727 । Siderophore उत्पादन गेहूं की जीनोटाइप द्वारा स्पष्ट रूप से प्रभावित किया गया था, और संयंत्र के ऊतकों के विशिष्ट प्रकार में मनाया । हम सफलतापूर्वक siderophore उत्पादन, स्थलीय और जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों में एक महत्वपूर्ण समारोह पर संयंत्र जीनोटाइप के प्रभाव के लिए तेजी से स्क्रीन करने के लिए हमारे विधि का इस्तेमाल किया । हम कई तकनीकी दोहराने का उत्पादन किया, बहुत विश्वसनीय मिट्टी में सांख्यिकीय अंतर उपज और संयंत्र के ऊतकों के भीतर । महत्वपूर्ण बात, परिणाम दिखाने के प्रस्तावित विधि तेजी से विश्वसनीयता के एक उच्च स्तर के साथ जटिल नमूनों में siderophore उत्पादन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक तरह से है कि समुदायों को बाद में काम के लिए संरक्षित करने के लिए taxa और कार्यात्मक जीन की पहचान की अनुमति देता है ।
Introduction
Siderophores जैव उपलब्धता के लिए मुख्य रूप से लौह-केलेशनथेरेपी में शामिल हैं, लेकिन अतिरिक्त प्रयोजनों की एक विस्तृत सरणी के साथ एक माइक्रोबियल कोरम संवेदन से लेकर स्थलीय और जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों, माइक्रोबियल संयंत्र-मेजबानों को संकेत, संयंत्र विकास संवर्धन, सहयोग और जटिल माइक्रोबियल समुदायों के भीतर प्रतियोगिता1,2। Siderophores मोटे तौर पर अपने सक्रिय साइटों और संरचनात्मक सुविधाओं के अनुसार वर्गीकृत किया जा सकता है, चार बुनियादी प्रकार बनाने: carboxylate, hydroxamate, catecholate, और मिश्रित प्रकार3,4। कई सूक्ष्मजीवों siderophore5 और जटिल समुदायों में से एक से अधिक प्रकार के उत्सर्जन, झिल्ली रिसेप्टर्स के एक विशाल बहुमत siderophores1की एक भी व्यापक विविधता के ऊपर उठाने की अनुमति देने के लिए सक्षम हैं, 6. हाल के काम इंगित करता है कि siderophores समुदाय के स्तर पर विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं, और यहां तक कि अंतर किंगडम संचार और biogeochemical स्थानांतरण में7,8,9,10 ,11.
क्रोम azurol sulphonate (कैस) के लिए एक chelating एजेंट के रूप में 30 से अधिक वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है लोहे (fe) इस तरह से बांध के रूप में है कि लाइगैंडों के अलावा (यानी, siderophores) कैस-Fe परिसर के पृथक्करण में परिणाम कर सकते हैं, एक आसानी से पहचाने बनाने के माध्यम में रंग परिवर्तन 12. जब कैस fe के साथ ही बंधे है, डाई एक शाही नीले रंग के रूप में प्रकट होता है, और कैस-fe जटिल dissociates के रूप में, मध्यम परिवर्तन ligand के प्रकार के अनुसार रंग fe13सफ़ाई के लिए इस्तेमाल किया । प्रारंभिक, तरल आधारित १९८७ में Schwyn और Neilands द्वारा स्थापित माध्यम, कई मायनों में संशोधित किया गया है बदलने के लिए माइक्रोबियल14लक्ष्यों को समायोजित, विकास वाला और सीमाएं15, साथ ही साथ Fe के अलावा धातुओं की एक किस्म, सहित एल्यूमिनियम, मैंगनीज, कोबाल्ट, कैडमियम निकेल, लिथियम, जिंक16, कॉपर17, और यहां तक कि आर्सेनिक18।
कई मानव रोगजनकों, साथ ही संयंत्र विकास को बढ़ावा देने के सूक्ष्मजीवों (PGPM) siderophore उत्पादक जीवों के रूप में पहचान की गई है3,19,20, और महत्वपूर्ण rhizosphere और endophytic PGPM अक्सर परीक्षण siderophore-उत्पादन के लिए सकारात्मक4. पारंपरिक Fe आधारित तरल विधि siderophore उत्पादन21के लिए खेती में अलग के microtiter परीक्षण के लिए अनुकूलित किया गया है । हालांकि, इन तकनीकों को एक पूरे के रूप में माइक्रोबियल समुदाय के महत्व को पहचानने में विफल (microbiome), सहयोग और मिट्टी और संयंत्र22प्रणालियों में siderophore उत्पादन के संभावित विनियमन में । कि कारण के लिए, हम एक उच्च प्रवाह siderophore उत्पादन के समुदाय स्तर का आकलन एक दिया पर्यावरण से विकसित किया है, पारंपरिक कैस परख पर आधारित है, लेकिन प्रतिकृति के साथ, माप की आसानी, विश्वसनीयता, और एक microplate में दोहराव परख.
इस अध्ययन में, एक लागत प्रभावी, उच्च प्रवाह siderophore उत्पादन का पता लगाने के लिए कैस-Fe परख के लिए जटिल नमूनों से siderophore उत्पादन के संवर्धन का आकलन प्रस्तुत किया है (यानी, मिट्टी और संयंत्र ऊतक homogenates) । थोक, लचर बंधे, और कसकर बंधे rhizosphere मिट्टी (कैसे मिट्टी जड़ से बंधे थे के संदर्भ में) अनाज, गोली मार, और चार अलग गेहूं (Triticum aestivum एल) पादी: Lewjain, Madsen, PI561725, और जड़ से ऊतकों के साथ प्राप्त किया गया PI561727 । यह परिकल्पना की गई थी कि गेहूं पादी में बुनियादी मतभेदों की भर्ती में मतभेद और siderophore उत्पादन समुदायों के चयन में परिणाम सकता है । विशेष रूप से ब्याज की PI561725 isogenic लाइन है, जो एल्यूमीनियम सहिष्णु है क्योंकि यह ALMT1 (एल्यूमीनियम सक्रिय Malate ट्रांसपोर्टर 1), एल्यूमीनियम के साथ तुलना के साथ जुड़े माइक्रोबियल समुदायों के बीच अंतर है संवेदनशील PI561727 isogenic लाइन, जो जीन, almt123,24,25,26के एक गैर एल्यूमीनियम उत्तरदायी रूप के पास । अध्ययन के मुख्य उद्देश्य के लिए एक सरल, मात्रात्मक जटिल नमूना प्रकार के siderophore संवर्धन संस्कृतियों में siderophore उत्पादन का आकलन करते हुए भविष्य के काम के लिए संस्कृतियों के संरक्षण के एक सीधी, तेजी से विधि का विकास किया गया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम का प्राथमिक परिणाम एक नई पद्धति है कि तेजी से siderophore के लिए समृद्ध इस्तेमाल किया जा सकता है रोगाणुओं का उत्पादन करते हुए मात्रात्मक siderophore उत्पादन को मापने और पर्यावरण नमूने में गतिविधि है । कार्यप्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को प्रयोगशाला प्रक्रियाओं में सहायता के लिए कल्याणी Muhunthan, गेहूं जीनोटाइप संचयन के लिए ली Opdahl, वाशिंगटन राज्य Concord अंगूर अनुसंधान परिषद, और कृषि को बनाए रखने के लिए वाशिंगटन राज्य विश्वविद्यालय केंद्र का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं और एक BIOAg अनुदान के लिए प्राकृतिक संसाधनों के लिए इस काम का समर्थन । अतिरिक्त धन USDA द्वारा प्रदान की गई थी/
Materials
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
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