High-throughput Siderophore Screening från miljöprover: växt vävnader, Bulk jordar och odlingsbädden jordar
Summary
Vi presenterar ett protokoll för snabb screening av miljöprov för siderophore potential bidrar till mikronäringsämnen biotillgänglighet och omsättning i terrestra system.
Abstract
Sideroforer (lågmolekylärt metall kelaterande föreningar) är viktiga i olika ekologiska fenomen alltifrån järn (Fe) biogeokemiska cykling i jordar, till patogen konkurrens, växt tillväxtfrämjande och cross-rike signalering. Sideroforer är dessutom också kommersiella intresset bioupplösning och bioweathering av metall-bärande mineraler och malmer. En snabb, kostnadseffektiv och robust innebär att kvantitativt bedöma siderophore produktion i komplexa prover är nyckeln till att identifiera viktiga aspekter av ekologiska konsekvenserna av siderophore verksamhet, inklusive, roman siderophore producerar mikrober. Metoden presenteras här har utvecklats för att bedöma siderophore aktivitet i i-takt mikrobiomet gemenskaperna, miljöprov, såsom jord eller växt vävnader. Proverna var homogeniserad och utspädd i en modifierad M9 medium (utan Fe) och anrikning kulturer inkuberades i 3 dagar. Siderophore produktion bedömdes i prover vid 24, 48 och 72 timmar (h) med en roman 96 brunnar mikroplattan CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar assay, en anpassning av traditionellt tråkiga och tidskrävande kolorimetriska metoden för att bedöma siderophore verksamhet, som utförs på enskilda odlade mikrobiell isolat. Vi tillämpade vår metod till 4 olika genotyper/linjer av vete (Triticum aestivum L.), inklusive Lewjain, Madsen, och PI561725 och PI561727 som ofta odlas i inlandet Pacific Northwest. Siderophore produktionen påverkades helt klart av genotypen av vete, och i de särskilda typerna av växt vävnader observerades. Vi har framgångsrikt använt vår metod att snabbt skärmen för påverkan av växten genotyp på siderophore produktion, en nyckelfunktion i terrestra och akvatiska ekosystem. Vi producerade många tekniska replikat, ger mycket tillförlitliga statistiska skillnader i jordar och inom växt vävnader. Ännu viktigare, visar resultaten den föreslagna metoden kan användas för att snabbt behandla siderophore produktion i komplexa prover med en hög grad av tillförlitlighet, på ett sätt som gör att samhällen att bevaras för senare arbete att identifiera taxa och funktionella gener.
Introduction
Sideroforer är viktiga biomolekyler deltar främst i järn-kelering för biotillgänglighet, men med ett brett utbud av ytterligare syften i terrestra och akvatiska ekosystem alltifrån mikrobiell quorum sensing, signalering till mikrobiell växt-värdar, växternas tillväxtfrämjande, samarbete och konkurrens inom komplexa mikrobiella samhällen1,2. Sideroforer kan grovt delas enligt deras aktiva webbplatser och strukturella funktioner, att skapa fyra grundläggande typer: bildas, hydroxamate, catecholate, och blandade typer3,4. Många mikroorganismer klarar av att utsöndra mer än en typ av siderophore5 och i komplexa samhällen, en stor majoritet av organismer biosynthesize membran receptorerna så att upptaget av ett ännu bredare utbud av sideroforer1, 6. Senaste arbete visar att sideroforer är särskilt viktiga på gemenskapsnivå, och även i Inter kungariket kommunikation och biogeokemiska överföringar7,8,9,10 ,11.
Chrome azurol sulphonate (CAS) har använts i över 30 år som en kelatbildare binda järn (Fe) på ett sådant sätt att tillägget av ligander (dvs. sideroforer) kan resultera i dissociation av CAS-Fe komplexet, skapa en lätt identifierbar färg förändringar på medellång 12. När the CAS är bundna med Fe, färgen visas som en royal blå färg och som CAS-Fe komplexet dissocierar, medellång ändrar färg beroende på typ av liganden som används för att rensa de Fe13. Den inledande, vätskebaserade medium som grundades 1987, av Schwyn och Neilands har ändrats på många sätt att rymma ändra mikrobiell mål14, tillväxt vanor och begränsningar15, samt en mängd olika metaller förutom Fe, inklusive aluminium, mangan, kobolt, kadmium nickel, litium, zink16, koppar17och även arsenik18.
Många mänskliga patogener, samt som växt tillväxt att främja mikroorganismer (PGPM) har identifierats som siderophore-producerande organismer3,19,20, och viktiga odlingsbädden och Endofytisk PGPM ofta testa positivt för siderophore-produktion4. Den traditionella Fe-baserade flytande metoden har anpassats till mikrotiter testning av isolat i odling för siderophore produktion21. Dock dessa tekniker inte inser vikten av mikrobiell gemenskapen som helhet (mikrobiomet), i samarbete och potentiella reglering av siderophore produktion i jordar och växt system22. Därför har vi utvecklat en hög genomströmning gemenskapsnivå bedömning av siderophore produktion från en viss miljö, baserad på den traditionella CAS-analysen, men med replikering, enkel mätning, pålitlighet och repeterbarhet i en mikroplattan assay.
I denna studie presenteras en kostnadseffektiv, hög genomströmning CAS-Fe-analys för att upptäcka siderophore produktion för att bedöma anrikningen av siderophore produktion från komplexa prover (dvs, mark och anläggning vävnad homogenates). Bulk, löst bundna och tätt-bundna odlingsbädden jord (i termer av hur jorden var bunden till roten) erhölls tillsammans med korn, skjuta och roten vävnader från fyra distinkta vete (Triticum aestivum L.) genotyper: Lewjain, Madsen, PI561725, och PI561727. Det antogs att grundläggande skillnader i de vete genotyperna kan leda till skillnader i rekrytering och urval av siderophore producerar samhällen. Av särskilt intresse är skillnaden mellan mikrobiella samhällen är associerad med PI561725 syngena linjen, vilket är aluminium toleranta eftersom det äger ALMT1 (aluminium-aktiverad Malate transportören 1), jämfört med aluminium känsliga PI561727 syngena line, som äger en icke-aluminium responsiv form av genen, almt123,24,25,26. Det främsta syftet med studien var att utveckla en enkel, snabb metod för att kvantitativt bedöma siderophore produktion i siderophore anrikning kulturer av komplexa provtyper samtidigt bevara kulturer för det framtida arbetet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det primära resultatet av detta arbete är produktionen av en ny metod som kan användas för att snabbt berika för siderophore producerar mikrober medan kvantitativt mäta siderophore/produktionsverksamhet i miljömässiga provet. Metoden är snabb, enkel och kostnadseffektiv, och resultaten visar hur det kan användas för att upptäcka siderophore aktivitet från komplexa och romanen provtyper (e.g., jord och växt vävnad). Protokollet också resulterar i produktion av glycerol lager av anrikning kulturer,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Kalyani Muhunthan för bistånd i laboratorierutiner, Lee Opdahl för skörd av vete-genotyp, Washington State Concord Grape forskningsrådet och Washington State University Center for upprätthålla jordbruket och Naturresurser för ett BIOAg bidrag för att stödja detta arbete. Ytterligare finansiering tillhandahölls av den USDA/NIFA genom lucka projektet 1014527.
Materials
| Agarose | Apex | LF451320014 | |
| Aluminum Baking Pan | |||
| Aluminum Foil | |||
| Ammonium chloride, granular | Fiesher Scientific | 152315A | |
| Autoclave and Sterilizer | Thermo Scientific | ||
| Calcium chloride dihydrate | Fiesher Scientific | 171428 | |
| CAS (Chrome Azurol S) | Chem-Impex Int'l Inc) | 000331-27168 | |
| Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder | Fiesher Scientific | 1521754 | |
| EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal | J.T.Baker | JI2476 | |
| Glycerol, Anhydrous | Baker Analyzed | C22634 | |
| HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide | Reagent World | FZ0941 | |
| Hydrochloride acid | ACROS Organic | B0756767 | |
| Infinite M200 PRO plate reader | TECAN | ||
| Iron (III) chloride hexahydrate, 99% | ACROS Organic | A0342179 | |
| Laboratory Fume Hood | Thermo Scientific | ||
| Laboratory Incubator | VWR Scientific | ||
| Magnesium Sulfate | Fiesher Scientific | 27855 | |
| Niric Acid, (69-70)% | J.T.Baker | 72287 | |
| PIPES buffer, 98.5% | ACROS Organic | A0338723 | |
| Potassium phosphate, dibaisc,powder | J.T.Baker | J48594 | |
| Pyoverdine | SIGMA-ALDRICH | 078M4094V | |
| Sand | |||
| SI-600R Shaker | Lab Companion | ||
| Sodium chloride, granular | Fiesher Scientific | 136539 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J.T.Baker | G48K53 | |
| Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% | ACROS Organic | A0371705 |
References
- Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
- Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64 (3), 725-737 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23 (5), 3984-3999 (2016).
- Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28 (4), 1327-1350 (2012).
- Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. , (2018).
- Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
- Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- O’Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364 (15), (2017).
- Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28 (13), (2018).
- Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284 (1852), (2017).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28 (3), 391-401 (2012).
- Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57 (8), 2246-2250 (1991).
- Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70 (1), 127-131 (2007).
- Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53 (11), 913-916 (2013).
- Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12 (12), 3067-3075 (2017).
- Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
- Desai, A., Archana, G. . Role of Siderophores in Crop Improvement. , (2011).
- Dertz, E. A., Raymond, K. N., Que, L., Tolman, W. B. . Comprehensive coordination chemistry II. 8, (2003).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
- Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254 (2), 617-626 (2017).
- Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238 (4), 657-668 (2013).
- Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37 (5), 645-653 (2004).
- Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8 (132), (2017).
- Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127 (2), 193-199 (2002).
- McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
- Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34 (1), 35-44 (2000).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
