儿童疾病生物标志物发现的呼吸收集
Summary
该协议描述了一种从儿童身上采集呼吸样本的简单方法。简单地说, 混合空气样品在气相色谱-质谱分析之前, 先在吸附剂管中进行预浓缩。使用这种呼吸收集方法可以确定传染病和非传染性疾病的呼吸生物标志物。
Abstract
呼吸收集和分析可用于发现疟疾、结核病、肺癌和肝病等一些传染病和非传染性疾病中的挥发性生物标志物.该协议描述了一种可重复的方法, 用于在儿童中采样呼吸, 然后稳定呼吸样本, 以便使用气相色谱-质谱联用 (gc-ms) 进行进一步分析。这种方法的目的是建立一个标准化的协议, 从4-15 的儿童身上采集呼吸样本, 以便进一步进行化学分析。首先, 使用连接到双向阀门上的纸板喉舌对呼吸进行采样, 该口子连接到3l 袋上。呼吸分析物然后被转移到热解吸管中, 并存储在 4-5, 直到分析。这种技术以前已被用来捕捉疟疾儿童的呼吸, 以成功地识别呼吸生物标志物。随后, 我们成功地将这一技术应用于其他儿科队列。这种方法的优点是, 它需要患者的最低限度的合作 (在儿科人口中具有特殊价值), 收集时间很短, 不需要训练有素的工作人员, 可以使用便携式设备在资源有限的字段设置。
Introduction
生物标志物可以产生关于正常和病理生物过程的有价值的信息, 这些过程可能导致临床可识别的疾病。最近, 人们越来越关注将呼吸挥发物作为各种疾病状态的生物标志物进行评估, 包括感染、代谢紊乱和癌症1。呼气含有可量化的挥发性有机化合物 (vocs)、半挥发性有机化合物和微生物衍生材料 (例如细菌和病毒的核酸)。呼气分析的中心目标是深入了解非侵入性医疗状况和/或环境暴露的状况。根据感兴趣的成分, 有多种方法可以收集和分析呼气。目前还没有标准化的呼气采集方法, 这使得对各种研究结果的比较分析复杂化。标准化的呼吸收集程序至关重要, 因为取样程序本身对呼吸分析的下游结果有相当大的影响。
在许多研究中, 呼吸后期采样采用了2,3.这种采样包括丢弃呼气的初始部分 (“死空间”), 以便在呼吸周期结束时优先捕捉空气。这种策略的优点是, 它最大限度地减少了外源 voc (如环境挥发性有机化合物) 的水平, 同时丰富了内生的、针对患者的挥发性有机化合物。此方法排除在收集呼吸样本之前从单个中呼出的前几秒钟。其他研究人员使用压力传感器在预定义的到期阶段激活采样4,5。由于压力传感器需要复杂的工程, 这种替代方法需要专用且成本相对较高的采样装置。
儿童呼吸采样可能特别具有挑战性。一个主要关切是, 幼儿可能无法配合自愿呼出 “死空间” 空气的议定书。因此, 从儿童身上获得混合呼吸更容易。然而, 混合呼吸样本的一个主要警告是环境和材料污染的风险。因此, 儿科收藏的可行性是该领域的一个驱动问题。
此外, 对于采集方法, 呼吸样品的储存也会影响样品的质量。呼吸中的高湿度和挥发性有机呼吸化合物的超低浓度 (每万亿分之) 使得呼吸样本特别容易受到与储存6,7有关的问题的影响。尽管质子转移反应质谱 (ptr-ms) 等实时技术潜力巨大, 但 gc-ms 仍然是分析呼吸样本的黄金标准。由于气检的 gc-ms 分析是一种离线技术, 它与预浓缩方法 (如热解吸管、固相微萃取和针陷阱装置) 相结合。在预浓缩之前, 呼吸样品需要暂时储存在聚合物袋中8。聚合物袋之所以受欢迎, 是因为它们价格适中, 耐久性相对较好, 可重用性强。虽然袋子可以重复使用, 但需要时间和精力来确保高效清洁7,8。每种特定的包类型还需要经过经验确定和标准化的程序来进行质量控制、可重用性和恢复。
td 管被广泛用于呼吸预浓缩, 因为它们捕获大量挥发物, 并且可以定制。用于包装 td 管的吸收材料可适用于特定的应用和感兴趣的特定目标挥发物。td 管极大地提高了呼吸生物标志物研究的便利性, 特别是在偏远的现场, 因为 td 管安全地储存呼吸挥发物至少两周, 并且易于运输3。
为了规范儿童的呼吸收集生物标志物的发现, 我们在这里描述了一个简单的方法来收集幼儿的呼吸。为了说明已实施的方案的代表性结果, 正在进行非酒精性脂肪酸肝病 (nafld) 评估的儿童 (8-17) 中提供了被取消识别的数据。这项研究的全部结果和分析将在以后的出版物中报告。在这项工作中, 我们报告了一个数据子集, 以演示我们协议的应用。简单地说, 孩子们被指示通过喉舌正常呼气到一个聚合物袋子里, 就像 “吹气球” 一样。这个过程重复2-4 次, 直到收集到1升的呼吸。然后将样品转移到 td 管中, 并在 gc-ms 分析之前在5°c 下储存。
Protocol
Representative Results
Discussion
尽管在过去十年中在呼吸研究方面取得了相当大的进展, 但对呼吸气体挥发物进行取样和分析的标准化做法仍未确定10。缺乏标准化的一个主要原因是呼吸收集方法的多样性, 这直接影响到任何特定呼气样本中由此产生的化学多样性。呼气液含有广泛的挥发性有机化合物, 浓度千差万别.因此, 改变收集方法不仅改变了特定样品中可能存在的化合物的丰度, 也改变了…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢参加这项研究的圣路易斯儿童医院的儿童和家庭。我们感谢斯泰西·波斯马女士和珍妮特·索科利奇女士在呼吸收集过程中作出的独特努力。这项工作得到圣路易斯儿童医院基金会的支持。
Materials
| Breath bag | SKC | 237-03 | These are 3 L bags |
| Cardboard mouthpiece | A-M systems | 161902 | 0.86" OD, 2.00" L |
| Large diameter tubing | Cole Parmer | 95802-11 | Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Long-term storage caps | Markes International | C-CF010 | Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10 |
| Male adapter | Charlotte Pipe | 2109 | Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005) |
| Male adapter (made from Teflon) | In-house built | Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon | |
| Pump | SKC | 220-1000TC-C | Pocket PumpTouch with Charger |
| Small diameter tubing | Supelco | 20533 | Teflon tubing L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) |
| Thermal desorption tubes | Markes International | C2-CAXX-5314 | Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10 |
| Tube capping/uncapping tool | Markes International | C-CPLOK | |
| Two-way ball valve connector | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Part 2/3 of breath connector (1/2") |
References
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