Collezione di respiro dai bambini per la scoperta di Biomarker di malattia
Summary
Questo protocollo descrive un metodo semplice per l’acquisizione di campioni di aria espirata da bambini. Brevemente, campioni di aria mista pre-sono concentrati in tubi sorbente prima dell’analisi gas cromatografia spettrometria di massa. Biomarcatori di respiro delle malattie infettive e non infettive possono essere identificati usando questo metodo di raccolta di respiro.
Abstract
Analisi e raccolta di respiro può essere utilizzati per scoprire volatili biomarcatori in un certo numero di malattie infettive e non infettive, come la malaria, la tubercolosi, cancro ai polmoni e affezione epatica. Questo protocollo descrive un metodo riproducibile per il campionamento di respiro nei bambini e quindi stabilizzare campioni di aria espirata per ulteriori analisi con spettrometria della cromatografia-massa del gas (GC-MS). L’obiettivo di questo metodo è quello di stabilire un protocollo standardizzato per l’acquisizione di campioni di aria espirata per ulteriore analisi chimica, da bambini di 4-15 anni. In primo luogo, respiro viene campionata utilizzando un boccaglio cartone attaccato ad una valvola 2 vie, che è collegata ad un sacchetto di 3L. Respiro analiti sono poi trasferiti in una provetta di desorbimento termico e conservati a 4-5 ° C fino all’analisi. Questa tecnica è stata utilizzata in precedenza per catturare il respiro dei bambini con la malaria per identificazione di biomarcatori di successo respiro. Successivamente, abbiamo applicato con successo questa tecnica per ulteriori coorti pediatriche. Il vantaggio di questo metodo è che esso richiede la cooperazione minimo da parte del paziente (di particolare valore nella popolazione pediatrica), ha un periodo di breve raccolta, non richiede personale specializzato e può essere eseguita con apparecchiature portatili in impostazioni del campo di risorse limitate.
Introduction
Biomarcatori possono fornire preziose informazioni circa processi biologici normali e patologici che possono contribuire alla malattia clinicamente identificabile. Recentemente, c’è stato un crescente interesse nella valutazione di sostanze volatili respiro come biomarcatori per una varietà di Stati di malattia, compreso l’infezione, disordini metabolici e cancro 1. Espirata contiene livelli quantificabili di composti organici volatili (COV), composti organici semi-volatili e microbica derivato materiale (ad es., acidi nucleici da batteri e virus). L’obiettivo centrale dell’analisi del respiro esalato è di approfondire lo stato di una condizione medica e/o esposizioni ambientali non invadente. Ci sono vari metodi per la raccolta e l’analisi di respiro esalato, a seconda i costituenti di interesse. Attualmente non esiste un metodo di raccolta standardizzata di respiro esalato, che complica l’analisi comparativa dei risultati attraverso gli studi. Standardizzazione delle procedure di raccolta del respiro è essenziale, come la stessa procedura di campionamento ha un effetto notevole sui risultati a valle dell’analisi del respiro.
In molti studi, tardo respiratorio respiro campionamento è autonomo2,3. Questo campionamento coinvolge scartando la parte iniziale di respiro esalato (“dead space”), al fine di catturare preferenzialmente l’aria alla fine del ciclo del respiro. Il vantaggio di questa strategia è che riduce al minimo i livelli di VOC esogeni (ad es., ambientale COV), arricchendo per COV endogeno, specifico per ogni paziente. Questo metodo esclude i primi secondi di espirazione da un individuo prima di prelevare il campione di respiro. Altri ricercatori hanno utilizzato un sensore di pressione per attivare campionamento durante una fase di predefiniti di scadenza4,5. Poiché i sensori di pressione richiedono ingegneria complesso, questo metodo alternativo richiede un dispositivo di campionamento dedicato e relativamente costoso.
Campionamento alito pediatrica può essere particolarmente impegnativo. La preoccupazione principale è che i bambini piccoli sia in grado di cooperare con protocolli per volontario espirazione dell’aria “dead space”. Per questo motivo, è più facile ottenere misto respiratorio respiro da bambini. Tuttavia, un avvertimento importante con campioni di aria espirata respiratoria mista è il rischio di contaminazione ambientale e dei materiale. Di conseguenza, la fattibilità della raccolta pediatrica è una preoccupazione di guida nel campo.
Inoltre, per i metodi di raccolta, stoccaggio di campioni di aria espirata può anche influenzare la qualità del campione. L’alta umidità in respiro exhalata e l’ultra-basse concentrazioni (parti per trilione) di respiro organici volatili composti fanno campioni di aria espirata particolarmente suscettibili a problemi legati al deposito6,7. Nonostante le grandi potenzialità delle tecniche in tempo reale come spettrometria di reazione-massa trasferimento di protone (PTR-MS), GC-MS rimane il gold standard per l’analisi di campioni di aria espirata. Analisi GC-MS di campioni di aria espirata, essendo una tecnica non in linea, è accoppiato con i metodi di pre-concentrazione quali tubi di desorbimento termico (TD), micro-estrazione in fase solida e dispositivi trappola dell’ago. Prima del pre-concentrazione, è necessario essere memorizzati temporaneamente in polimero borse8campioni di aria espirata. Borse di polimero sono popolari a causa del loro prezzo moderato, relativamente buona durevolezza e riusabilità. Mentre borse possono essere riutilizzati, tempo e fatica sono tenuti ad assicurare l’efficiente pulizia7,8. Ogni tipo di borsa specifica richiede anche empiricamente determinate e standardizzate le procedure per il controllo di qualità, riutilizzo e recupero.
TD tubi sono ampiamente utilizzati per pre-concentrazione respiro perché catturare un gran numero di sostanze volatili e possono essere personalizzati. I materiali assorbenti utilizzati per il confezionamento TD tubi possono essere adattati alle particolari applicazioni e sostanze volatili particolare target di interesse. TD tubi sostanzialmente migliorare la convenienza di studi di biomarcatore respiro, soprattutto in siti remoti, perché TD tubi tranquillamente conservare sostanze volatili respiro per almeno due settimane e sono facili da trasporto3.
Nel tentativo di standardizzare la raccolta di respiro pediatrica per la scoperta del biomarcatore, qui descriviamo un metodo semplice per raccogliere il respiro da bambini piccoli. Per illustrare i risultati rappresentativi dei protocolli implementati, i dati sono presentati da un gruppo in corso dei bambini (età 8-17) in fase di valutazione per la malattia dell’acido grasso non alcolica del fegato (NAFLD). Risultati completi e analisi di questo studio verranno segnalati in una pubblicazione successiva. In questo lavoro, segnaliamo un sotto insieme di dati per dimostrare l’applicazione del nostro protocollo. In breve, i bambini sono istruiti per espirare normalmente tramite boccaglio in un sacchetto di polimero, come se “soffiando un palloncino”. Il processo viene ripetuto 2 – 4 volte fino a 1 L di respiro sono raccolti. Il campione è quindi trasferito in una provetta di TD e conservato a 5 ° C prima dell’analisi GC-MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nonostante i notevoli progressi nella ricerca di respiro nell’ultimo decennio, le pratiche standardizzate per il campionamento e l’analisi di composti volatili respiro gas rimangono indefiniti10. Un motivo principale per questa mancanza di standardizzazione è stato la diversità dei metodi di raccolta di respiro, che hanno un impatto diretto sulla diversità chimica risultante presenti in qualsiasi campione dato respiro esalato. Respiro exhalata contiene una vasta gamma di composti organici volat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esprimiamo la nostra gratitudine per i bambini e le famiglie dell’ospedale di St. Louis bambini che hanno partecipato a questo studio. Riconosciamo gli sforzi unici della signorina Stacy Postma e Sig. ra Janet Sokolich durante l’accumulazione di respiro. Questo lavoro è sostenuto dalla Fondazione Ospedale dei bambini St. Louis.
Materials
| Breath bag | SKC | 237-03 | These are 3 L bags |
| Cardboard mouthpiece | A-M systems | 161902 | 0.86" OD, 2.00" L |
| Large diameter tubing | Cole Parmer | 95802-11 | Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Long-term storage caps | Markes International | C-CF010 | Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10 |
| Male adapter | Charlotte Pipe | 2109 | Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005) |
| Male adapter (made from Teflon) | In-house built | Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon | |
| Pump | SKC | 220-1000TC-C | Pocket PumpTouch with Charger |
| Small diameter tubing | Supelco | 20533 | Teflon tubing L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) |
| Thermal desorption tubes | Markes International | C2-CAXX-5314 | Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10 |
| Tube capping/uncapping tool | Markes International | C-CPLOK | |
| Two-way ball valve connector | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Part 2/3 of breath connector (1/2") |
References
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