Adem collectie van kinderen voor ziekte Biomarker ontdekking
Summary
Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het verwerven van de monsters van de adem van de kinderen. Monsters van gemengde lucht zijn kort, vooraf geconcentreerd in sorptiemiddel buizen vóór gaschromatografie-massaspectrometrie analyse. Adem biomarkers voor infectieuze en niet-infectieuze ziekten kunnen worden geïdentificeerd met behulp van deze methode adem collectie.
Abstract
Adem verzameling en analyse kunnen worden gebruikt om te ontdekken van vluchtige biomarkers in een aantal infectieuze en niet-infectieuze ziekten, zoals malaria, tuberculose, longkanker en leverziekte. Dit protocol beschrijft een reproduceerbare methode voor de bemonstering van de adem in kinderen en adem monsters voor verdere analyse met gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) vervolgens te stabiliseren. Het doel van deze methode is om een gestandaardiseerde protocol voor de verwerving van adem monsters voor verdere chemische analyse, van kinderen in de leeftijd van 4-15 jaar. Ten eerste adem bemonsterd met een kartonnen mondstuk gekoppeld aan een 2-weg klep, die is verbonden met een zak van 3 L. Adem analyten zijn vervolgens overgebracht naar een thermische desorptie-buis en opgeslagen bij 4-5 ° C tot analyse. Deze techniek is eerder gebruikt om vast te leggen van de adem van kinderen met malaria voor succesvolle adem biomerker identificatie. Vervolgens hebben we deze techniek met succes toegepast op extra pediatrische cohorten. Het voordeel van deze methode is dat het vereist minimale samenwerking van de kant van de patiënt (van bijzondere waarde in pediatrische populaties), een korte periode heeft, geen opgeleid personeel vereist en kan worden uitgevoerd met draagbare apparatuur in resource-limited Veldinstellingen.
Introduction
Biomarkers kunnen waardevolle informatie over normale en pathologische biologische processen die tot klinisch aantoonbare ziekte bijdragen kunnen opleveren. Onlangs, is er toenemende belangstelling voor de evaluatie van adem vluchtige stoffen als biomarkers voor een verscheidenheid van ziekte staten, met inbegrip van infectie, metabole aandoeningen en kanker 1. Uitgeademde adem bevat kwantificeerbare niveaus van vluchtige organische stoffen (VOS), semi-vluchtige organische stoffen en microbially afgeleide materiaal (bijvoorbeeld nucleïnezuren tegen bacteriën en virussen). Het centrale doel van uitgeademde adem analyse is inzicht te krijgen in de status van een medische aandoening en/of milieu vorderingen niet-gebeurt. Er zijn verschillende methoden voor het verzamelen en analyseren van uitgeademde adem, afhankelijk van de kiezers van belang. Er is momenteel geen gestandaardiseerde uitgeademde adem collectie methode, die vergelijkende analyse van de resultaten over studies bemoeilijkt. Standaardisering van de procedures voor het verzamelen van adem is essentieel, aangezien de bemonsteringsprocedure zelf een aanzienlijke effect op de downstream resultaten van analyses van de adem heeft.
In vele studies is laat respiratoire adem bemonstering werknemer2,3. Deze bemonstering omvat teruggooi van het eerste gedeelte van de uitgeademde adem (“dead space”), om te vangen bij voorkeur de lucht aan het einde van de cyclus van de adem. Het voordeel van deze strategie is dat minimaliseert het de niveaus van exogene VOC (bijvoorbeeld milieu Vos), terwijl het verrijken voor endogene, patiënt-specifieke Vos. Deze methode sluit de eerste paar seconden van uitademing van een individu voordat het adem-monster te verzamelen. Andere onderzoekers hebben een druksensor bemonstering tijdens een vooraf gedefinieerde fase van vervaldatum4,5te activeren in dienst. Omdat druksensoren complexe techniek vereist, vereist deze alternatieve methode een specifieke en relatief dure bemonsteringsapparatuur.
Pediatrische adem bemonstering kunnen bijzonder uitdagend. Een sleutelelement is dat jonge kinderen wellicht niet in staat om samen te werken met protocollen voor vrijwillige uitademen van lucht van de “dead space”. Om deze reden is het gemakkelijker te verkrijgen van gemengde respiratoire adem van kinderen. Een belangrijke caveat met gemengde respiratoire adem monsters is echter het risico van besmetting van het milieu- en materiaal. Daarom is de haalbaarheid van pediatrische collectie een drijvende zorg in het veld.
Daarnaast, vergaringsmethoden, kan de opslag van adem monsters monster kwaliteit ook beïnvloeden. De hoge luchtvochtigheid in adem exhalate en de ultra-lage concentraties (delen-per-biljoen) van adem van vluchtige organische verbindingen maken adem monsters vooral gevoelig voor problemen in verband met opslag6,7. GC-MS blijft ondanks het grote potentieel van real-time technieken zoals Reactiemassa spectrometrie (PTR-MS) van de overdracht van de proton, de gouden standaard voor de analyse van monsters van de adem. Aangezien GC-MS analyses van monsters van de adem een off line techniek is, gaat het gepaard met pre concentratie methoden zoals thermische desorptie (TD) buizen, vaste fase micro-extractie en naald val-apparaten. Voorafgaand aan de pre concentratie moeten adem monsters worden tijdelijk opgeslagen in polymeer zakken8. Polymeer tassen zijn populair vanwege hun gematigde prijs, relatief goede duurzaamheid en hergebruik. Terwijl zakken kunnen worden hergebruikt, zijn tijd en moeite vereist om ervoor te zorgen efficiënte reiniging7,8. Elk type specifieke zak vereist ook empirisch bepaald en gestandaardiseerde procedures voor kwaliteitscontrole, hergebruik en terugwinning.
TD buizen worden veel gebruikt voor adem pre concentratie omdat zij een groot aantal vluchtige stoffen verzamelen en kunnen worden aangepast. De absorberende materialen gebruikt voor het verpakken van TD buizen kunnen worden aangepast aan de specifieke toepassingen en specifieke doelorgaan vluchtige stoffen van belang. TD buizen aanzienlijk verbeteren van het gemak van adem biomerker studies, met name op extern gebied sites, omdat TD buizen veilig opslaan van adem vluchtige stoffen gedurende ten minste twee weken en zijn eenvoudig te vervoer3.
In een poging om te standaardiseren pediatrische adem-collectie voor de ontdekking van biomarker, beschrijven we hier een eenvoudige methode voor het verzamelen van adem van jonge kinderen. Ter illustratie van de representatieve resultaten van de uitgevoerde protocollen, de geïdentificeerde gegevens worden gepresenteerd tot een cohort behoren, gaande van kinderen (leeftijd 8-17) ondergaan evaluatie voor vetzuur lever ziekte (NAFLD). Volledige uitslag en analyse van deze studie zal in een latere publicatie worden gerapporteerd. In dit werk rapporteren we een deelverzameling van de gegevens te tonen van de toepassing van onze protocol. Kortom, zijn kinderen geïnstrueerd om normaal uitademen via het mondstuk in de zak van een polymeer, alsof “blaast een ballon.” Het proces wordt herhaald 2 – 4 keer tot 1 L van adem wordt opgehaald. Het monster is vervolgens overgebracht in een TD-buis en opgeslagen bij 5 ° C vóór de GC-MS-analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ondanks aanzienlijke vooruitgang in adem onderzoek in het afgelopen decennium blijven gestandaardiseerde procedures voor de bemonstering en analyse van adem gas vluchtige stoffen ongedefinieerd10. Een primaire reden voor dit gebrek aan standaardisatie is de diversiteit van de adem vergaringsmethoden, die directe invloed op de resulterende chemische diversiteit in bepaalde uitgeademde adem monster aanwezig hebben geweest. Adem exhalate bevat een uitgebreid scala aan vluchtige organische stoffen op …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We onze dankbaarheid uiten aan de kinderen en de gezinnen van St Louis Children’s Hospital, die hebben deelgenomen aan deze studie. Wij erkennen de unieke inspanningen van Ms. Stacy Postma en mevrouw Janet Sokolich bij het verzamelen van de adem. Dit werk wordt ondersteund door de St. Louis Children’s Hospital Foundation.
Materials
| Breath bag | SKC | 237-03 | These are 3 L bags |
| Cardboard mouthpiece | A-M systems | 161902 | 0.86" OD, 2.00" L |
| Large diameter tubing | Cole Parmer | 95802-11 | Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Long-term storage caps | Markes International | C-CF010 | Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10 |
| Male adapter | Charlotte Pipe | 2109 | Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005) |
| Male adapter (made from Teflon) | In-house built | Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon | |
| Pump | SKC | 220-1000TC-C | Pocket PumpTouch with Charger |
| Small diameter tubing | Supelco | 20533 | Teflon tubing L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) |
| Thermal desorption tubes | Markes International | C2-CAXX-5314 | Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10 |
| Tube capping/uncapping tool | Markes International | C-CPLOK | |
| Two-way ball valve connector | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Part 2/3 of breath connector (1/2") |
References
- Ahmed, W. M., Lawal, O., Nilsen, T. M., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled volatile organic compounds of infection: a systematic review. ACS Infectious Diseases. 3 (10), 695-710 (2017).
- Berna, A. Z., et al. Analysis of breath specimens for biomarkers of Plasmodium falciparum infection. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1120-1128 (2015).
- Lawal, O., Ahmed, W. M., Nijsen, T. M. E., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled breath analysis: a review of ‘breath-taking’ methods for off-line analysis. Metabolomics. 13 (10), (2017).
- Kang, S., Thomas, C. L. P. How long may a breath sample be stored for at-80 degrees C? A study of the stability of volatile organic compounds trapped onto a mixed Tenax:Carbograph trap adsorbent bed from exhaled breath. Journal of Breath Research. 10 (2), (2016).
- Basanta, M., et al. Non-invasive metabolomic analysis of breath using differential mobility spectrometry in patients with chronic obstructive pulmonary disease and healthy smokers. Analyst. 135 (2), 315-320 (2010).
- Mochalski, P., et al. Blood and breath levels of selected volatile organic compounds in healthy volunteers. Analyst. 138 (7), 2134-2145 (2013).
- Mochalski, P., Wzorek, B., Sliwka, I., Amann, A. Suitability of different polymer bags for storage of volatile sulphur compounds relevant to breath analysis. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (3), 189-196 (2009).
- Mochalski, P., King, J., Unterkofler, K., Amann, A. Stability of selected volatile breath constituents in Tedlar, Kynar and Flexfilm sampling bags. Analyst. 138 (5), 1405-1418 (2013).
- Schaber, C., et al. Breathprinting reveals malaria-associated biomarkers and mosquito attractants. Journal of Infectious Diseases. 217 (10), 1553-1560 (2018).
- Herbig, J., Beauchamp, J. Towards standardization in the analysis of breath gas volatiles. Journal of Breath Research. 8 (3), (2014).
- Phillips, M., et al. Variation in volatile organic compounds in the breath of normal humans. Journal of Chromatography B. 729 (1-2), 75-88 (1999).
- Eckel, S. P., Baumbach, J., Hauschild, A. C. On the importance of statistics in breath analysis-hope or curse?. Journal of Breath Research. 8 (1), (2014).
