נשימה אוסף ילדים למען גילוי סמן מחלה
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לצורך רכישת דגימות נשימה מילדים. בקצרה, דגימות אוויר מעורב מרוכזים מראש צינורות sorbent לפני ניתוח גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית. ניתן לזהות סמנים ביולוגיים נשימה של מחלות זיהומיות, שאינן זיהומיות בשיטה זו אוסף נשימה.
Abstract
נשימה איסוף וניתוח יכול לשמש כדי לגלות סמנים ביולוגיים נדיף במספר מחלות זיהומיות שאינן זיהומיות, כגון מלריה, שחפת, סרטן ריאות מחלת כבד. פרוטוקול זה מתאר שיטה ישימה עבור דגימה נשימה אצל ילדים וייצוב ואז דגימות נשימה לצורך ניתוח נוסף עם גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS). מטרת שיטה זו היא ליצור פרוטוקול מתוקננת לצורך רכישת דגימות נשימה לצורך ניתוח כימי נוסף, של ילדים בגילאי 4-15 שנים. ראשית, נשימה נדגמים באמצעות דוברת מקרטון מחובר שסתום 2-way, אשר מחובר אל שקית 3 L. נשימה analytes לאחר מכן הועבר צינור desorption תרמית, המאוחסנים ב 4-5 ° C עד הניתוח. טכניקה זו שימש בעבר ללכוד את הנשימה של ילדים עם מלריה לזיהוי סמן נשימה מוצלחת. לאחר מכן, אנחנו בהצלחה החלת טכניקה זו על גדודים ילדים נוספים. היתרון של שיטה זו הוא כי דורש שיתוף מינימלית של המטופל (של ערך מסוים בקרב אוכלוסיות ילדים), תקופה קצרה אוסף, לא דורשת צוות מיומן בו ניתן לבצע באמצעות ציוד נייד הגדרות שדה משאב מוגבל.
Introduction
סמנים ביולוגיים יכולות להניב מידע חיוני על תהליכים ביולוגיים נורמליים ופתולוגיים שעשויים לתרום קלינית לזיהוי המחלה. לאחרונה, יש כבר עניין גובר בהערכה של נשימה שיכללו חומרים נדיפים כמו סמנים ביולוגיים למגוון רחב של מצבי מחלה, כולל זיהום, הפרעות מטבוליות סרטן 1. והבל הפה מכיל רמות לכימות של תרכובות אורגניות נדיפות (Voc), תרכובות אורגניות נדיפות למחצה, microbially נגזרת חומר (למשל, חומצות גרעין מפני חיידקים ווירוסים). המטרה המרכזית של ניתוח והבל הפה הוא להשיג תובנה המצב של מצב רפואי ו/או חשיפות סביבתיות לא פולשני. ישנן שיטות שונות עבור איסוף וניתוח והבל הפה, בהתאם המרכיבים של עניין. כיום יש אין שיטה אוסף מתוקננת והבל הפה, אשר מסבך ניתוח השוואתי של תוצאות מעבר ללימודים. האחדת נשימה אוסף נהלים חיוני, כמו הליך הדגימה עצמה יש השפעה רבה על התוצאות במורד הזרם של נשימה ניתוחים.
במחקרים רבים, מאחר נשימה נשימה הדגימה הוא המועסקים2,3. דגימה זו כרוכה השמטת את החלק הראשוני של והבל הפה (“שטח מת”), על מנת ללכוד את האוויר מעדיפים בסוף מחזור נשימה. היתרון של אסטרטגיה זו היא כי מצמצם את רמות VOC אקסוגני (למשל, איכות הסביבה Voc), תוך העשרת עבור Voc אנדוגני, מטופל ספציפי. שיטה זו אינה כוללת השניות הראשונות של נשיפה מאדם בודד לפני איסוף המדגם נשימה. חוקרים אחרים המועסקים חיישן לחץ כדי להפעיל את הדגימה במהלך תקופה מוגדרת מראש של תפוגה4,5. מכיוון חיישני לחץ דורשים הנדסה מורכבים, שיטה חלופית זו דורשת מכשיר דגימה ייעודי ויקר יחסית.
דגימה נשימה בילדים יכול להיות מאתגר במיוחד. מופעיו היא ילדים צעירים עשויים להיות מסוגלים לשתף פעולה עם פרוטוקולים עבור מרצון נשיפה של אוויר “שטח מת”. מסיבה זו, קל יותר להשיג נשימה נשימה מעורבת של ילדים. אזהרה גדולה עם דגימות נשימה נשימה מעורבות זאת, הסיכון של זיהום סביבתי, החומרי. לכן, הכדאיות של אוסף ילדים היא דאגה נהיגה בשטח.
בנוסף, שיטות איסוף, אחסון של דגימות נשימה יכול להשפיע גם על איכות דגימת. הלחות הגבוהה exhalate נשימה, ריכוז נמוך במיוחד (חלקים-לכל-טריליון) נשימה אורגניים נדיפים תרכובות להפוך נשימה דגימות רגישים במיוחד לבעיות הקשורות לאחסון6,7. למרות הפוטנציאל הגדול של טכניקות בזמן אמת כמו פרוטון העברה התגובה-ספקטרומטריית (PTR-MS), GC-MS עדיין תקן הזהב לניתוח של דגימות נשימה. מאז GC-MS ניתוח דוגמאות הנשימה הוא שיטת מנותק, זה משולב עם ריכוז קדם שיטות כגון צינורות התרמי desorption (TD), מיקרו-מיצוי מעבדתי והתקני מלכודת המחט. לפני קדם ריכוז, דגימות נשימה צריך להיות מאוחסנים באופן זמני בפולימר שקיות8. פולימר שקיות פופולריים בשל מחיר מתון שלהם, עמידות טובה יחסית, שימושית. בזמן ייתכן ניתנים לשימוש חוזר בתוך שקיות, זמן ומאמץ נדרשים על מנת להבטיח יעילות ניקוי7,8. כל סוג תיק מסוים דורש גם נחושה מדעית ושגרות מתוקנן עבור בקרת איכות, שימושית ושחזור.
צינורות TD נמצאים בשימוש נרחב עבור הנשימה ריכוז מראש כי הם ללכוד מספר גדול של שיכללו חומרים נדיפים, יכול להיות מותאם אישית. החומרים סופג בהם אריזה צינורות TD עשוי להיות מותאם כדי שיכללו חומרים נדיפים מסויימת עניין ויישומים מסוימים. TD צינורות באופן משמעותי לשפר את הנוחות של מחקרים סמן נשימה, במיוחד באתרים מרחוק שדה, כי TD צינורות בבטחה לאחסן שיכללו חומרים נדיפים נשימה במשך לפחות שבועיים, בקרבת תחבורה3.
במאמץ לתקנן נשימה בילדים אוסף עבור גילוי סמן, כאן אנו מתארים שיטה פשוטה כדי לאסוף את הנשימה של ילדים צעירים. כדי להמחיש את התוצאות נציג של הפרוטוקולים מיושמים, מוצגים נתונים מבטל את שזוהה מ פוסקת קוהורטה של הילדים (גיל 8-17) שעברו הערכה למחלה ללא אלכוהול חומצת שומן בכבד (אלכוהולי NAFLD). תוצאות מלאות וניתוח של מחקר זה ידווחו בפרסום מאוחר יותר. בעבודה זאת, מדווחים ערכת משנה נתונים כדי להדגים את היישום של פרוטוקול שלנו. בקצרה, הילדים הורו נשוף בדרך כלל באמצעות פייה לשקית פולימר, כאילו “לפוצץ בלון”. התהליך חוזר על עצמו 2 – 4 פעמים עד 1 ליטר נשימה נאסף. המדגם הוא לאחר מכן הועבר לתוך צינור TD, המאוחסנים ב 5 ° C לפני ניתוח GC-MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות התקדמות ניכרת בחקר הנשימה בעשור האחרון, נהלים סטנדרטיים עבור דגימה וניתוח של נשימה גז שיכללו חומרים נדיפים נשאר לא מוגדר10. הסיבות העיקריות על היעדר סטנדרטיזציה כבר המגוון של שיטות איסוף נשימה, אשר יש השפעה ישירה על המגוון כימי שנוצר נוכח דוגמה נתון והבל הפה. נשימה exhalate ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מביעים את הכרת התודה שלנו ילדים ובני משפחותיהם של החולים סיינט לואיס לילדים שהשתתפו במחקר זה. אנו להכיר המאמצים ייחודי של גב’ סטייסי פוסטמה, גברת ג’נט Sokolich במהלך איסוף נשימה. עבודה זו נתמכת על ידי קרן בית החולים לילדים סנט לואיס.
Materials
| Breath bag | SKC | 237-03 | These are 3 L bags |
| Cardboard mouthpiece | A-M systems | 161902 | 0.86" OD, 2.00" L |
| Large diameter tubing | Cole Parmer | 95802-11 | Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Long-term storage caps | Markes International | C-CF010 | Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10 |
| Male adapter | Charlotte Pipe | 2109 | Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005) |
| Male adapter (made from Teflon) | In-house built | Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon | |
| Pump | SKC | 220-1000TC-C | Pocket PumpTouch with Charger |
| Small diameter tubing | Supelco | 20533 | Teflon tubing L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) |
| Thermal desorption tubes | Markes International | C2-CAXX-5314 | Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10 |
| Tube capping/uncapping tool | Markes International | C-CPLOK | |
| Two-way ball valve connector | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Part 2/3 of breath connector (1/2") |
References
- Ahmed, W. M., Lawal, O., Nilsen, T. M., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled volatile organic compounds of infection: a systematic review. ACS Infectious Diseases. 3 (10), 695-710 (2017).
- Berna, A. Z., et al. Analysis of breath specimens for biomarkers of Plasmodium falciparum infection. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1120-1128 (2015).
- Lawal, O., Ahmed, W. M., Nijsen, T. M. E., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled breath analysis: a review of ‘breath-taking’ methods for off-line analysis. Metabolomics. 13 (10), (2017).
- Kang, S., Thomas, C. L. P. How long may a breath sample be stored for at-80 degrees C? A study of the stability of volatile organic compounds trapped onto a mixed Tenax:Carbograph trap adsorbent bed from exhaled breath. Journal of Breath Research. 10 (2), (2016).
- Basanta, M., et al. Non-invasive metabolomic analysis of breath using differential mobility spectrometry in patients with chronic obstructive pulmonary disease and healthy smokers. Analyst. 135 (2), 315-320 (2010).
- Mochalski, P., et al. Blood and breath levels of selected volatile organic compounds in healthy volunteers. Analyst. 138 (7), 2134-2145 (2013).
- Mochalski, P., Wzorek, B., Sliwka, I., Amann, A. Suitability of different polymer bags for storage of volatile sulphur compounds relevant to breath analysis. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (3), 189-196 (2009).
- Mochalski, P., King, J., Unterkofler, K., Amann, A. Stability of selected volatile breath constituents in Tedlar, Kynar and Flexfilm sampling bags. Analyst. 138 (5), 1405-1418 (2013).
- Schaber, C., et al. Breathprinting reveals malaria-associated biomarkers and mosquito attractants. Journal of Infectious Diseases. 217 (10), 1553-1560 (2018).
- Herbig, J., Beauchamp, J. Towards standardization in the analysis of breath gas volatiles. Journal of Breath Research. 8 (3), (2014).
- Phillips, M., et al. Variation in volatile organic compounds in the breath of normal humans. Journal of Chromatography B. 729 (1-2), 75-88 (1999).
- Eckel, S. P., Baumbach, J., Hauschild, A. C. On the importance of statistics in breath analysis-hope or curse?. Journal of Breath Research. 8 (1), (2014).
