Ånde samling fra børn til sygdom biomarkør opdagelse
Summary
Denne protokol beskriver en simpel metode til erhvervelse af ånde prøver fra børn. Kort, prøver af blandede luft er pre koncentreret i sorptionsmiddel rør inden gaskromatografi-massespektrometri analyse. Ånde biomarkører for smitsomme og ikke-smitsomme sygdomme kan identificeres ved hjælp af denne ånde samling metode.
Abstract
Ånde indsamling og analyse kan bruges til at opdage flygtige biomarkører i en række smitsomme og ikke-smitsomme sygdomme som malaria, tuberkulose, lungekræft og leversygdom. Denne protokol beskriver en reproducerbar metode for prøveudtagning ånde hos børn og så stabilisere ånde prøver til yderligere analyse med gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS). Målet med denne metode er at etablere en standardiseret protokol til erhvervelse af ånde prøver til yderligere kemisk analyse, fra børn i alderen 4-15 år. Først, ånde er stikprøven ved hjælp af en pap talerør knyttet til en 2-vejs ventil, som er tilsluttet en 3 L taske. Ånde analysander er derefter overført til en termisk desorption tube og opbevares ved 4-5 ° C indtil analyse. Denne teknik har tidligere været anvendt til fange pust af børn med malaria for vellykket ånde biomarkør identifikation. Efterfølgende, har vi med succes anvendt denne teknik til yderligere pediatric kohorter. Fordelen ved denne metode er at det kræver minimal samarbejde på en del af patienten (af ganske særlig værdi i pædiatriske populationer), har en kort samling periode, kræver ikke uddannet personale, og kan udføres med bærbart udstyr i ressource-begrænset Feltindstillinger.
Introduction
Biomarkører kan give værdifulde oplysninger om normale og patologiske biologiske processer, der kan bidrage til klinisk identificerbar sygdom. For nylig har der været stigende interesse for evaluering af ånde flygtige stoffer som biomarkører for en række sygdomstilstande, herunder infektion, metaboliske sygdomme og kræft 1. Udåndede ånde indeholder målbare niveauer af flygtige organiske forbindelser (VOC), semi-flygtige organiske forbindelser og microbially afledt materiale (f.eks. nukleinsyrer fra bakterier og vira). Det centrale mål for udåndede ånde analyse er at få indsigt i status for en medicinsk tilstand og/eller miljømæssige eksponeringer ikke-invasivt. Der er forskellige metoder til indsamling og analyse af udåndede ånde, afhængigt af bestanddelene af interesse. I øjeblikket er der ingen standardiseret udåndede ånde indsamlingsmetode, hvilket komplicerer sammenlignende analyse af resultater på tværs af undersøgelser. Standardisere ånde samling procedurer er væsentlige, som prøveudtagningsproceduren, selv har en betydelig indvirkning på downstream resultaterne af ånde analyser.
I mange undersøgelser er sent respiratorisk ånde prøveudtagning ansat2,3. Denne prøveudtagning indebærer kassere den indledende del af udåndede ånde (“dead space”), for at fange fortrinsvis i luften i slutningen af den ånde cyklus. Fordelen ved denne strategi er at det minimerer niveauer af eksogene VOC (fx miljømæssige VOC), mens berigende for endogene, patient-specifikke VOC. Denne metode omfatter ikke de første par sekunder af udånding fra en individuel før indsamling åndedrag prøve. Andre efterforskere har ansat en tryksensor at aktivere prøveudtagning i en foruddefineret fase af udløb4,5. Fordi tryksensorer kræver komplekst ingeniørarbejde, kræver denne alternative metode en dedikeret og relativt dyre prøveudtagning enhed.
Pediatric ånde prøveudtagning kan være særligt udfordrende. Et hovedanliggende er at unge børn kan være ude af stand til at samarbejde med protokoller for frivillig udånding af luft, “dead space”. Af denne grund er det lettere at få blandet respiratorisk ånde fra børn. Dog er en større advarsel med blandet respiratorisk ånde prøver risiko for kontaminering, miljømæssige og materiale. Derfor er muligheden for pediatric samling en drivende bekymring i feltet.
Hertil kommer, at indsamlingsmetoder, kan opbevaring af ånde prøver også påvirke prøve kvalitet. Den høje luftfugtighed i ånde exhalate og ultra-lave koncentrationer (dele pr billioner) af flygtige organiske ånde forbindelser gør ånde prøver særligt modtagelige over for problemer i forbindelse med opbevaring6,7. Trods det store potentiale af real-time teknikker som proton overførsel reaktion-massespektrometri (PTR-MS) fortsat GC-MS guldstandarden til analyse af ånde prøver. Da GC-MS analyse af ånde prøver er en offline teknik, er det kombineret med pre koncentration metoder som termisk desorption (TD) rør, faste fase mikro-udvinding og nål fælde enheder. Før præ koncentration skal ånde prøver gemmes midlertidigt i polymer poser8. Polymer tasker er populære på grund af deres moderat pris, relativt god holdbarhed og genanvendelighed. Mens poser kan genbruges, er tid og kræfter nødvendige for at sikre effektiv rengøring7,8. Hver specifikke taske type kræver også empirisk bestemmes og standardiserede procedurer for kvalitetskontrol, genbrug og nyttiggørelse.
TD rør er almindeligt brugt til ånde pre koncentration fordi de fange et stort antal af flygtige stoffer og kan tilpasses. De absorberende materiale anvendes til pakning TD rør kan tilpasses til særlige anvendelser og særlige mål flygtige stoffer af interesse. TD rør væsentligt forbedre bekvemmeligheden af ånde biomarkør undersøgelser, især i fjerntliggende områder, fordi TD rør sikkert gemme ånde flygtige stoffer i mindst to uger og er nemme at transport3.
I et forsøg på at standardisere pediatric ånde samling for biomarkør opdagelse, beskriver vi her en simpel metode til at indsamle ånde fra småbørn. For at illustrere de repræsentative resultater af de gennemførte protokoller, præsenteres de identificerede data fra en igangværende kohorte af børn (8-17 år) gennemgår evalueringen for ikke-alkoholiske fedtsyre lever sygdom (NAFLD). Fuld resultater og analyse af denne undersøgelse vil blive rapporteret i en senere publikation. I dette arbejde rapportere vi et sub-sæt af data til at dokumentere anvendelsen af vores protokol. Kort sagt, børn bliver bedt om at udånder normalt via talerør i en polymer taske, som om “blæser en ballon.” Processen gentages 2 – 4 gange indtil 1 L af ånde er indsamlet. Prøven er derefter overført til en TD tube og opbevares ved 5 ° C inden GC-MS analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trods betydelige fremskridt i ånde forskning i det sidste årti forblive standardiserede metoder til prøveudtagning og analyse af ånde gas flygtige stoffer udefineret10. Den primære årsag til denne mangel på standardisering har været mangfoldigheden af ånde samling metoder, som har direkte indvirkning på den deraf følgende kemiske diversitet i enhver given udåndede åndedrag prøve. Ånde exhalate indeholder et omfattende udvalg af flygtige organiske forbindelser ved meget varieret konc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi udtrykker vores taknemmelighed over for børn og familier af St Louis children’s Hospital, der har deltaget i denne undersøgelse. Vi anerkender Ms. Stacy Postma og Ms. Janet Sokolich unikke indsats under samlingen ånde. Dette arbejde støttes af St. Louis children’s Hospital Foundation.
Materials
| Breath bag | SKC | 237-03 | These are 3 L bags |
| Cardboard mouthpiece | A-M systems | 161902 | 0.86" OD, 2.00" L |
| Large diameter tubing | Cole Parmer | 95802-11 | Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Long-term storage caps | Markes International | C-CF010 | Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10 |
| Male adapter | Charlotte Pipe | 2109 | Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005) |
| Male adapter (made from Teflon) | In-house built | Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon | |
| Pump | SKC | 220-1000TC-C | Pocket PumpTouch with Charger |
| Small diameter tubing | Supelco | 20533 | Teflon tubing L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) |
| Thermal desorption tubes | Markes International | C2-CAXX-5314 | Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10 |
| Tube capping/uncapping tool | Markes International | C-CPLOK | |
| Two-way ball valve connector | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Part 2/3 of breath connector (1/2") |
References
- Ahmed, W. M., Lawal, O., Nilsen, T. M., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled volatile organic compounds of infection: a systematic review. ACS Infectious Diseases. 3 (10), 695-710 (2017).
- Berna, A. Z., et al. Analysis of breath specimens for biomarkers of Plasmodium falciparum infection. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1120-1128 (2015).
- Lawal, O., Ahmed, W. M., Nijsen, T. M. E., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled breath analysis: a review of ‘breath-taking’ methods for off-line analysis. Metabolomics. 13 (10), (2017).
- Kang, S., Thomas, C. L. P. How long may a breath sample be stored for at-80 degrees C? A study of the stability of volatile organic compounds trapped onto a mixed Tenax:Carbograph trap adsorbent bed from exhaled breath. Journal of Breath Research. 10 (2), (2016).
- Basanta, M., et al. Non-invasive metabolomic analysis of breath using differential mobility spectrometry in patients with chronic obstructive pulmonary disease and healthy smokers. Analyst. 135 (2), 315-320 (2010).
- Mochalski, P., et al. Blood and breath levels of selected volatile organic compounds in healthy volunteers. Analyst. 138 (7), 2134-2145 (2013).
- Mochalski, P., Wzorek, B., Sliwka, I., Amann, A. Suitability of different polymer bags for storage of volatile sulphur compounds relevant to breath analysis. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (3), 189-196 (2009).
- Mochalski, P., King, J., Unterkofler, K., Amann, A. Stability of selected volatile breath constituents in Tedlar, Kynar and Flexfilm sampling bags. Analyst. 138 (5), 1405-1418 (2013).
- Schaber, C., et al. Breathprinting reveals malaria-associated biomarkers and mosquito attractants. Journal of Infectious Diseases. 217 (10), 1553-1560 (2018).
- Herbig, J., Beauchamp, J. Towards standardization in the analysis of breath gas volatiles. Journal of Breath Research. 8 (3), (2014).
- Phillips, M., et al. Variation in volatile organic compounds in the breath of normal humans. Journal of Chromatography B. 729 (1-2), 75-88 (1999).
- Eckel, S. P., Baumbach, J., Hauschild, A. C. On the importance of statistics in breath analysis-hope or curse?. Journal of Breath Research. 8 (1), (2014).
