Pusten samling fra barn for sykdom biomarkør oppdagelsen
Summary
Denne protokollen beskriver en enkel metode for oppkjøpet av pusten prøver fra barn. Kort, prøver av blandede luften er pre konsentrert i absorberende rør før gass kromatografi-massespektrometri analyse. Pusten biomarkers av smittsomme og ikke-smittsomme sykdommer kan identifiseres med denne pusten samling metoden.
Abstract
Pusten innsamling og analyse kan brukes til å oppdage flyktige biomarkers i en rekke smittsomme og ikke-smittsomme sykdommer, som malaria, tuberkulose, lungekreft og leversykdom. Denne protokollen beskriver en reproduserbar metode for prøvetaking ånde hos barn og deretter stabilisere pusten prøver for videre analyse med gass kromatografi-massespektrometri (GC-MS). Målet med denne metoden er å etablere en standardisert protokoll for oppkjøpet av pusten prøver kjemiske analyser, fra barn i alderen 4-15 år. Først samples pusten ved hjelp av papp munnstykke knyttet til en 2-veis ventil, som er koblet til en 3 L bag. Pust analytter deretter overført til en termisk desorpsjon rør og lagret på 4-5 ° C før analysen. Denne teknikken har tidligere blitt brukt til å fange pusten av barn med malaria for vellykket pusten biomarkør identifikasjon. Deretter har vi har brukt denne teknikken å ekstra pediatric kohorter. Fordelen med denne metoden er at den krever minimal samarbeid på del av pasienten (av spesiell verdi pediatric bestander), har en kort samling perioden, krever ikke kvalifiserte ansatte, og kan utføres med bærbart utstyr i ressurs-begrenset Feltinnstillinger.
Introduction
Biomarkers kan gi verdifull informasjon om normal og patologisk biologiske prosesser som kan bidra til klinisk identifiserbar sykdom. Nylig har det vært økende interesse for evalueringen av pusten flyktige som biomarkers for en rekke sykdom stater, inkludert infeksjon, metabolske forstyrrelser og kreft 1. Skjermbilde for utåndet pusten inneholder kvantifiserbare nivåer av flyktige organiske forbindelser (VOCs), semi flyktige organiske forbindelser og microbially avledet materiale (f.eks nukleinsyrer mot bakterier og virus). Det sentrale målet for utåndet pusten analyse er å få innblikk i statusen for en medisinsk tilstand og/eller miljømessige eksponeringer ikke-invasively. Det finnes ulike metoder for å samle og analysere utåndet pust, avhengig av bestanddelene av interesse. Aktuelle finnes det ingen standardisert utåndet pusten samling metode, kompliserer komparativ analyse av resultater på tvers av studier. Standardisere pusten samlingen prosedyrer er viktig, som selve inngrepet prøvetaking har en betydelig effekt på nedstrømsresultatet på pusten analyser.
I mange studier er sent åndedretts pusten prøvetaking næringsdrivende2,3. Tallgrunnlaget innebærer forkaster den første delen av utåndet (“dead space”), for å fange fortrinnsvis luften på slutten av syklusen pusten. Fordelen med denne strategien er at det reduserer nivået av eksogene VOC (f.eks miljømessige VOCs), mens berikende for endogene, pasient-spesifikke VOCs. Denne metoden ekskluderer de første sekundene av utpust fra en individuell før samle det pust eksemplet. Andre etterforskere har ansatt en trykksensor til å aktivere prøvetaking i en forhåndsdefinert fasen av utløpsdato4,5. Trykk sensorer krever kompleks engineering, krever denne alternative metoden en dedikert og relativt dyrt prøvetakingsutstyr.
Pediatric pusten prøvetaking kan være spesielt utfordrende. En viktig bekymring er at små barn ikke kan samarbeide med protokoller for frivillig utpust av “dead space” luft. Derfor er det enklere å få blandet åndedretts pusten fra barn. En stor påminnelse med blandet åndedretts pusten prøver er imidlertid risikoen for miljø og materielle forurensning. Muligheten for pediatric samling er derfor en kjøring bekymring i feltet.
I tillegg til samling metoder, kan lagring av pusten prøver også påvirke utvalg kvalitet. Høy fuktighet i pusten exhalate og de svært lave konsentrasjonene (deler per billioner) av flyktige organiske pusten forbindelser gjøre pusten prøver spesielt utsatt for problemer knyttet til lagring6,7. Til tross for det store potensialet av sanntids teknikker som proton overføring reaksjon-massespektrometri (PTR-MS) forblir GC-MS gullstandarden for analyse av pusten prøver. Siden GC-MS analyse av pusten prøver er en teknikk som er frakoblet, den er kombinert med pre konsentrasjon metoder som termisk desorpsjon (TD) rør, solid fase mikro-utvinning og nål felle enheter. Før pre konsentrasjon må pusten prøver lagres midlertidig i polymer poser8. Polymer posene er populære på grunn av deres moderat pris, relativt god holdbarhet og reusability. Mens poser kan gjenbrukes, er tid og krefter nødvendig for å sikre effektiv rengjøring7,8. Hver bestemt bag type krever også empirisk bestemt og standardisert prosedyrer for kvalitetskontroll, gjenbruk og gjenvinning.
TD rør er mye brukt for pusten pre konsentrasjon fordi de fange et stort antall flyktige og kan tilpasses. Absorberende materialer for pakking TD rør kan tilpasses bestemte programmer og spesielle mål flyktige av interesse. TD rør vesentlig forbedre bekvemmeligheten av pusten biomarkør studier, spesielt ved eksterne feltet områder, fordi TD rør trygt lagre pusten flyktige i minst to uker og er enkle å transport3.
I et forsøk på å standardisere pediatric pusten samling for biomarkør oppdagelse, beskriver her vi en enkel metode for å samle pusten fra yngre barn. For å illustrere representant resultatene av implementert protokoller, presenteres de identifiserte data fra en pågående kohort av barn (alder 8-17) under evaluering for alkoholfrie fettsyrer leveren sykdom (NAFLD). Full resultatene og analyse av denne studien vil bli rapportert i senere publikasjoner. I dette arbeidet rapportere vi av data å demonstrere programmet av våre protokollen. I korthet, er barn pålagt å puster normalt via munnstykket til en polymer bag, som om “blåse en boble.” Prosessen gjentas 2 – 4 ganger til 1 L pusten samles. Prøven er deretter overført til en TD rør og lagret på 5 ° C før GC-MS analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Til tross for betydelig fremgang i pusten forskning det siste tiåret fortsatt standardisert praksis for prøvetaking og analyse av pusten gass flyktige udefinert10. En hovedårsak for denne mangelen på standardisering er mangfoldet av pusten samling metoder, som har direkte innvirkning på resulterende kjemiske mangfoldet i noen gitt utåndet pust eksemplar. Pust exhalate inneholder et omfattende utvalg av flyktige organiske forbindelser ved svært variert konsentrasjoner6</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uttrykke vår takknemlighet til barn og familiene til St Louis Children’s Hospital som deltok i denne undersøkelsen. Vi erkjenner unike innsatsen til Ms. Stacy Postma og Ms. Janet Sokolich under pusten samlingen. Dette arbeidet er støttet av St. Louis barnas sykehus fundament.
Materials
| Breath bag | SKC | 237-03 | These are 3 L bags |
| Cardboard mouthpiece | A-M systems | 161902 | 0.86" OD, 2.00" L |
| Large diameter tubing | Cole Parmer | 95802-11 | Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Long-term storage caps | Markes International | C-CF010 | Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10 |
| Male adapter | Charlotte Pipe | 2109 | Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005) |
| Male adapter (made from Teflon) | In-house built | Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon | |
| Pump | SKC | 220-1000TC-C | Pocket PumpTouch with Charger |
| Small diameter tubing | Supelco | 20533 | Teflon tubing L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) |
| Thermal desorption tubes | Markes International | C2-CAXX-5314 | Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10 |
| Tube capping/uncapping tool | Markes International | C-CPLOK | |
| Two-way ball valve connector | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Part 2/3 of breath connector (1/2") |
References
- Ahmed, W. M., Lawal, O., Nilsen, T. M., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled volatile organic compounds of infection: a systematic review. ACS Infectious Diseases. 3 (10), 695-710 (2017).
- Berna, A. Z., et al. Analysis of breath specimens for biomarkers of Plasmodium falciparum infection. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1120-1128 (2015).
- Lawal, O., Ahmed, W. M., Nijsen, T. M. E., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled breath analysis: a review of ‘breath-taking’ methods for off-line analysis. Metabolomics. 13 (10), (2017).
- Kang, S., Thomas, C. L. P. How long may a breath sample be stored for at-80 degrees C? A study of the stability of volatile organic compounds trapped onto a mixed Tenax:Carbograph trap adsorbent bed from exhaled breath. Journal of Breath Research. 10 (2), (2016).
- Basanta, M., et al. Non-invasive metabolomic analysis of breath using differential mobility spectrometry in patients with chronic obstructive pulmonary disease and healthy smokers. Analyst. 135 (2), 315-320 (2010).
- Mochalski, P., et al. Blood and breath levels of selected volatile organic compounds in healthy volunteers. Analyst. 138 (7), 2134-2145 (2013).
- Mochalski, P., Wzorek, B., Sliwka, I., Amann, A. Suitability of different polymer bags for storage of volatile sulphur compounds relevant to breath analysis. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (3), 189-196 (2009).
- Mochalski, P., King, J., Unterkofler, K., Amann, A. Stability of selected volatile breath constituents in Tedlar, Kynar and Flexfilm sampling bags. Analyst. 138 (5), 1405-1418 (2013).
- Schaber, C., et al. Breathprinting reveals malaria-associated biomarkers and mosquito attractants. Journal of Infectious Diseases. 217 (10), 1553-1560 (2018).
- Herbig, J., Beauchamp, J. Towards standardization in the analysis of breath gas volatiles. Journal of Breath Research. 8 (3), (2014).
- Phillips, M., et al. Variation in volatile organic compounds in the breath of normal humans. Journal of Chromatography B. 729 (1-2), 75-88 (1999).
- Eckel, S. P., Baumbach, J., Hauschild, A. C. On the importance of statistics in breath analysis-hope or curse?. Journal of Breath Research. 8 (1), (2014).
