Andedräkt samling från barn för sjukdom biomarkör identifiering
Summary
Det här protokollet beskriver en enkel metod för förvärvet av andedräkt prov från barn. Prover av blandad luft är kort, pre koncentrerade sorbent rör före gaskromatografi-masspektrometri analys. Andedräkt biomarkörer för smittsamma och icke-infektiösa sjukdomar kan identifieras här andedräkt samling metoden.
Abstract
Andedräkt insamling och analys kan användas för att upptäcka flyktiga biomarkörer i ett antal smittsamma och icke-smittsamma sjukdomar, som malaria, tuberkulos, lungcancer och leversjukdom. Det här protokollet beskriver en reproducerbar metod för provtagning andedräkt hos barn och sedan stabilisera andedräkt prover för vidare analys med gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS). Målet med denna metod är att införa ett standardiserat protokoll för förvärvet av andetag prover för vidare kemisk analys, från barn i åldrarna 4-15 år. Första samplas andetag med en kartong munstycke bifogas en 2-vägs ventil, som är ansluten till en 3 L påse. Andedräkt analyter sedan överförs till en termisk desorption tube och lagras vid 4-5 ° C fram till analys. Denna teknik har använts tidigare att fånga andan av barn med malaria för framgångsrika andedräkt biomarkör identifiering. Därefter har vi framgångsrikt tillämpat denna teknik till ytterligare pediatric kohorter. Fördelen med denna metod är att den kräver minimal samarbete på delen av patienten (särskilt värde i pediatriska populationer), har en kort kredittid, inte kräver utbildad personal och kan utföras med bärbar utrustning i begränsade resurser Fältinställningar.
Introduction
Biomarkörer kan ge värdefull information om normala och patologiska biologiska processer som kan bidra till kliniskt identifierbar sjukdom. Nyligen har det varit ökande intresse för utvärderingen av andetag flyktiga ämnen som biomarkörer för en mängd olika sjukdomstillstånd, inklusive infektioner, metabola sjukdomar och cancer 1. Utandningsluften innehåller mätbara halter av flyktiga organiska föreningar (VOC), semi flyktiga organiska föreningar och mikrobiellt härlett material (t.ex. nucleic syror från bakterier och virus). Det centrala målet för utandningsluften analys är att få insikt i status av ett medicinskt tillstånd eller miljöexponeringar icke-invasivt. Det finns olika metoder för att samla in och analysera utandningsluften, beroende på beståndsdelarna i intresse. För närvarande finns det ingen standardiserad utandningsluften samling metod, vilket försvårar jämförande analys av resultaten i studier. Standardisera andedräkt samling förfaranden är viktigt, som provtagningsförfarandet själv har en betydande inverkan på de nedströms analysresultat andetag.
I många studier är sena respiratoriska andedräkt provtagning anställd2,3. Denna provtagning innebär att kasta den första delen av utandningsluften (”dead space”), för att företrädesvis fånga luften i slutet av cykelns andetag. Fördelen med denna strategi är att det minimerar nivåerna av exogena VOC (t.ex. miljömässiga VOC), samtidigt berika för endogen, patientspecifika flyktiga organiska föreningar. Denna metod utesluter de första sekunderna av utandning individ innan du samlar in utandningsprov. Andra utredare har anställt en tryckgivare till aktivera provtagning under en fördefinierad fas av utgångsdatum4,5. Eftersom tryckgivare kräver komplexa engineering, kräver alternativa metoden dedikerad och relativt kostsamma provtagningsutrustning.
Pediatric andedräkt provtagning kan vara särskilt utmanande. En nyckelfråga är att små barn kan inte samarbeta med protokoll för frivilliga utandning av ”dead space” luft. Av denna anledning är det lättare att få blandat respiratorisk andetag från barn. En stor varning med blandat respiratorisk andedräkt prover är dock risken för förorening av miljön och materialet. Genomförbarheten av pediatric samling är därför en drivande oro i fältet.
Förutom att metoder för insamling, kan lagring av andetag prover också påverka prov kvalitet. Den höga luftfuktigheten i andetag exhalate och extremt låga koncentrationer (delar per-triljoner) av flyktiga organiska andedräkt föreningar gör andetag prover särskilt känsliga för problem relaterade till lagring6,7. Trots den stora potentialen som realtid tekniker som proton överföring reaktion-masspektrometri (PTR-MS) förblir GC-MS den gyllene standarden för analys av andetag prover. Eftersom GC-MS analys av andetag prover är en offline teknik, är det tillsammans med före koncentrationen metoder såsom termisk desorption (TD) rör, fast fas mikro-extraktion och nål fälla enheter. Före före koncentrationen behöver andetag prover lagras tillfälligt i polymer väskor8. Polymer väskor är populära på grund av deras moderat pris, relativt bra hållbarhet och återanvändbarhet. Medan väskor får återanvändas, är tid och ansträngning skyldiga att säkerställa effektiv rengöring7,8. Varje specifik väska typ kräver också empirically beslutsamt och standardiserade förfaranden för kvalitetskontroll, återanvändning och återvinning.
TD-rör används allmänt för andetag före koncentrationen eftersom de fånga ett stort antal flyktiga ämnen och kan anpassas. Absorberande material som används för att förpacka TD rören kan anpassas till särskilda program och visst mål flyktiga ämnen av intresse. TD rör väsentligen förbättra bekvämligheten av andetag biomarkör studierna, särskilt på remote fältet platser, eftersom TD rör säkert lagra andedräkt flyktiga ämnen i minst två veckor och är lätta att transport3.
I ett försök att standardisera pediatric andedräkt samling biomarkör identifiering, beskriver här vi en enkel metod för att samla in andetag från barn. För att illustrera de representativa resultat av genomförda protokoll, avidentifierade data presenteras från en pågående kohort av barn (8-17 år) som genomgår utvärdering för alkoholfria fettsyra lever sjukdom (NAFLD). Fullständiga resultat och analys av denna studie kommer att redovisas i en senare publikation. I detta arbete rapporterar vi en underuppsättning av data att demonstrera tillämpning av våra protokoll. I korthet, instrueras barnen att andas ut normalt via munstycket till en polymer påse, som om ”blåser en ballong”. Processen upprepas 2 – 4 gånger tills 1 L andedräkt samlas. Provet är sedan överföras till en TD rör och lagras vid 5 ° C före GC-MS analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trots betydande framsteg i andedräkt forskning det senaste decenniet fortfarande standardiserade metoder för provtagning och analys av andetag gas flyktiga ämnen odefinierad10. En primär anledning till denna brist på standardisering har varit mångfalden av metoder för insamling av andetag, vilket har direkt inverkan på den resulterande kemiska mångfalden i någon given utandningsluften provet. Andetag exhalate innehåller ett omfattande utbud av flyktiga organiska föreningar vid mycket v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uttrycker vår tacksamhet till barn och familjer i St Louis Barnens sjukhus som deltagit i denna studie. Vi erkänner Ms. Stacy Postma och Ms. Janet Sokolich unika insatser under samlingen andetag. Detta arbete stöds av St. Louis Children’s Hospital Foundation.
Materials
| Breath bag | SKC | 237-03 | These are 3 L bags |
| Cardboard mouthpiece | A-M systems | 161902 | 0.86" OD, 2.00" L |
| Large diameter tubing | Cole Parmer | 95802-11 | Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Long-term storage caps | Markes International | C-CF010 | Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10 |
| Male adapter | Charlotte Pipe | 2109 | Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005) |
| Male adapter (made from Teflon) | In-house built | Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon | |
| Pump | SKC | 220-1000TC-C | Pocket PumpTouch with Charger |
| Small diameter tubing | Supelco | 20533 | Teflon tubing L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) |
| Thermal desorption tubes | Markes International | C2-CAXX-5314 | Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10 |
| Tube capping/uncapping tool | Markes International | C-CPLOK | |
| Two-way ball valve connector | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Part 2/3 of breath connector (1/2") |
References
- Ahmed, W. M., Lawal, O., Nilsen, T. M., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled volatile organic compounds of infection: a systematic review. ACS Infectious Diseases. 3 (10), 695-710 (2017).
- Berna, A. Z., et al. Analysis of breath specimens for biomarkers of Plasmodium falciparum infection. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1120-1128 (2015).
- Lawal, O., Ahmed, W. M., Nijsen, T. M. E., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled breath analysis: a review of ‘breath-taking’ methods for off-line analysis. Metabolomics. 13 (10), (2017).
- Kang, S., Thomas, C. L. P. How long may a breath sample be stored for at-80 degrees C? A study of the stability of volatile organic compounds trapped onto a mixed Tenax:Carbograph trap adsorbent bed from exhaled breath. Journal of Breath Research. 10 (2), (2016).
- Basanta, M., et al. Non-invasive metabolomic analysis of breath using differential mobility spectrometry in patients with chronic obstructive pulmonary disease and healthy smokers. Analyst. 135 (2), 315-320 (2010).
- Mochalski, P., et al. Blood and breath levels of selected volatile organic compounds in healthy volunteers. Analyst. 138 (7), 2134-2145 (2013).
- Mochalski, P., Wzorek, B., Sliwka, I., Amann, A. Suitability of different polymer bags for storage of volatile sulphur compounds relevant to breath analysis. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (3), 189-196 (2009).
- Mochalski, P., King, J., Unterkofler, K., Amann, A. Stability of selected volatile breath constituents in Tedlar, Kynar and Flexfilm sampling bags. Analyst. 138 (5), 1405-1418 (2013).
- Schaber, C., et al. Breathprinting reveals malaria-associated biomarkers and mosquito attractants. Journal of Infectious Diseases. 217 (10), 1553-1560 (2018).
- Herbig, J., Beauchamp, J. Towards standardization in the analysis of breath gas volatiles. Journal of Breath Research. 8 (3), (2014).
- Phillips, M., et al. Variation in volatile organic compounds in the breath of normal humans. Journal of Chromatography B. 729 (1-2), 75-88 (1999).
- Eckel, S. P., Baumbach, J., Hauschild, A. C. On the importance of statistics in breath analysis-hope or curse?. Journal of Breath Research. 8 (1), (2014).
