Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

צמיחה ואפיון של אורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב

Published: May 3, 2019 doi: 10.3791/59293
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

אורגנואידים פיתח מבלוטות החלב של העכבר היו לקרינה מאופיין להעריך תכונות אפיתל ואינטראקציות עם תאים חיסוניים. ניתן להשתמש באורגנואידים הניתנים לקרינה כדי להעריך טוב יותר את האינטראקציות של תאי התא שעלולות להוביל לגיוס תאי גידול ברקמה נורמלית שניתן לקרינה.

Abstract

אורגנואידים נגזר מרקמת מתעכל הם רב-תאיים תלת מימדי (3D) מבנים כי טוב יותר לכידה בתנאים vivo מאשר תא monolayers. למרות שהם לא יכולים לגמרי לדגמן במורכבות vivo, הם שומרים כמה פונקציונליות של האיבר המקורי. ב מודלים סרטניים, אורגנואידים משמשים בדרך כלל כדי ללמוד הפלישה תא הגידול. פרוטוקול זה מטרתו לפתח ולאפיין אורגנואידים מרקמת בלוטת החלב הרגילה והקרינה הרדיואקטיבית כדי להעריך את תגובת הקרינה ברקמות רגילות. האורגנואידים האלה יכולים להיות מיושמים על עתיד בלימודי סרטן מבחנה כדי להעריך את האינטראקציות של תאי הגידול עם אורגנואידים לקרינה. בלוטות החלב היו resected, הקרינה עד 20 Gy מתעכל בתמיסה בקולגן השמיני. אורגנואידים אפיתל הופרדו באמצעות בידול צנטריפוגלי, ו 3D אורגנואידים פותחו ב 96-היטב מיקרופלטות הדבקה נמוכה. אורגנואידים הביע את סימן האפיתל האופייני ציטוקרטין 14. מקרופאג האינטראקציה עם האורגנואידים נצפתה בניסויים בשיתוף תרבות. מודל זה עשוי להיות שימושי עבור לימוד אינטראקציות הגידול סטרומה, הסתננות של תאים חיסוניים, ו מקרופאג קיטוב בתוך סביבת מיקרו הקרינה.

Introduction

כ 60% של סרטן השד שליליים משולשת (TNBC) מטופלים בוחרים בשד-שימור טיפול (BCT) כסוג של טיפול1. במובן זה מודאליות, הגידול המכיל חלק של רקמת השד מוסר, ואת הרקמה הנורמלית המקיפה נחשפת קרינה מייננת להרוג כל שרידי תאים סרטניים. הטיפול מפחית הישנות יותר של אוכלוסיית סרטן השד; עם זאת, כ 13.5% של חולים מטופלים עם החוויה TNBC לוקליזציה מופעים חוזרים2. לכן, ללמוד כיצד קרינה יכול לגייס תאים סרטניים במחזור (ctcs) יוביל לתובנות חשובות להישנות המקומי3,4.

העבודה הקודמת הראתה כי הקרינה של רקמות נורמלי מגביר את הגיוס של סוגי תאים שונים5. במודלים טרום קליניים של TNBC, הקרנה של רקמה נורמלית גדל מקרופאג ולאחר מכן הגידול התא הגיוס לרקמות נורמלי5. המצב החיסוני השפיעו על גיוס תאים סרטניים לאתרים שנחשפו לקרינה, עם הגירה תא הגידול נצפתה בנושאים חיסוני. העברת האינטראקציות הללו תוך שימוש באורגנואידים הנגזרים מבלוטות החלב תאפשר צפייה בהעברת תאים ואינטראקציות תאים מסטרומה בזמן אמת עם מיקרוסקופ ודימות תאים חיים כדי לקבוע את התפקיד של נזקי קרינה בשנות התנהגות תא הגידול.

אורגנואידים של העכבר עזרו להבהיר שלבי מפתח בהתפתחות בלוטת החלב. מבנה החלב הוא מגוון, שלושה מימדים המבנה של אפיתל החלב בודד כי הוא גדול יותר 50 יקרומטר6,7,8,9,10. באמצעות מארגני האפיתל העיקרי, Simian ואח ' העריך את הגורמים הדרושים עבור הסתעפות בבלוטת החלב7. שמיר ואח ' גילה כי הפצת יכול להתרחש ללא האפיתל למעבר mesenchymal, מתן תובנה האשד הגרורתי8. שיטות להפקת ואפיון אורגנואידים מרקמת בלוטת החלב מבוססים היטב6,11,12,13. עם זאת, על הידע שלנו, שיטות לגידול מאורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב לא דווחו. פרוטוקול לגידול ולאפיון של אורגנואידים הקרינה יהיה צעד מכריע בארגון לכידה של הקרינה הנגרמת החיסונית והגידול תאים.

במאמר זה, אנו מדווחים על שיטה לגידול ולאפיון אפיתל הפטמות המנואידים במיקרופלטות נמוכות מצופות בפולימר הידרופילי התומך בהיווצרות הספרואידים. האורגנואידים האלה היו שותפים לתרבות עם מקרופאגים כדי לבחון קינטיקה חיסונית הסתננות של תאים. עבודה זו ניתן להרחיב כדי לכלול co-culturing אורגנואידים עם תאים האדיפוז מאפייני החלב, תאים סרטניים השד כדי להמחיש הזרקור תאים הגידול, ו CD8 + T תאים ללמוד גידול-אינטראקציות תאים חיסוניים. ניתן להשתמש בפרוטוקולים שנקבעו בעבר כדי להעריך את האורגנואידים הניתנים לקרינה. מוקדם יותר דגמים שיתוף החלב אורגנואידים ותאים חיסוניים יש לשפוך אור על מנגנונים של גרורות והפצת. DeNardo ואח ' מצא כי CD4 + T בוויסות התאים של מקרופאגים הקשורים הגידול משופרת פניטיפ גרוטיפים של הפטמות אדנוקרצינומות14. בנוסף, נעשה שימוש במודלים של תרבות משותפת כדי להבהיר מנגנונים לפיתוח ביולוגי. פלקס ואח ' הבהיר את תפקידה של CD4 + T כתאי הרגולטורים של החלב באורגאוגנזה15. עם זאת, הקבוצה שלנו היא הראשונה להקים הליך להמחיש כיצד הקרנה רקמה נורמלית משפיע על התנהגות התא החיסונית. מכיוון הקרנה רקמה נורמלית הוכח לשפר את הגיוס תאים סרטניים5, פרוטוקול זה ניתן לפתח עוד כדי לנתח כיצד התנהגות התאים הסרטניים משתנה על ידי הקרנה של רקמות ותאים נורמליים, המוביל להבנה רבה יותר של סרטן הישנות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

לימודי בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים המוסדיים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ואנדרבילט.

1. הכנת עכברים ורכישת תאים (מותאם מ-נגוין-Ngoc et al.11)

  1. להקריב את העכברים Nu/Nu (8-10 שבועות בן) באמצעות שיתוף2 חנק ואחריו פריקה צווארי. לנקות את העור באמצעות 70% אתנול.
  2. לכרות בלוטות החלב הבטן והאינרינאלה מעכברים באמצעות מספריים טרום מעוקר ומלקחיים. הסר בלוטות הלימפה לפני ההסרה. שטפו בתמיסת מלח מעוקר באגירה בגודל 1 x (PBS) (איור 1X).
  3. מניחים אותו 15 מ ל צינורות עם 10 מ ל של דולבקה שונה מדיה נשר/תערובת מזינים F12 (Dמאמ/F12) עבור הובלה. ניתן להשאיר דגימות בין לילה ב -4 ° c או בעיבוד מיידי. . המשיכו לאכול
  4. הקרינים דגימות ב 20 Gy באמצעות מקור צסיום (איור 1B).
  5. 45 דקות לאחר ההקרנה, המקום בלוטות החלב בלוח 35 מ"מ תא סטרילי והומה עם אזמלים (איור 1C, D). האוהב עם כ 40 משיכות עד הרקמה מרגיע וחתיכות מתקבלים כי הם לא גדולים יותר כ 1 מ"מ2 באזור.
  6. העבר לפתרון הקולגן בתוך צינור הצנטריפוגה 50 mL. הפתרון מורכב 2 מ"ג/mL הקולגן (ראה טבלה של חומרים), 2 מ"ג/ml טריפסין, 5% v/v סרום בקר העוברי (fbs), 5 Μg/ml אינסולין, ו 50 Μg/ml GENTAMICIN ב Dmem/F12 מדיה. השתמש ב-10 מ"ל הפתרון הקולגן לכל עכבר.
  7. מניחים באמבט מים ב 37 ° c, vortexing כל 10 דקות עבור 30-60 דקות. העיכול מושלם כאשר התמיסה הקולגן מעונן (איור 1E, F).
  8. לסובב את הפתרון מתעכל ב 450 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שלוש שכבות יובחנו. הסופרנטאנט מורכב משומן, השכבה האמצעית היא פתרון מימית, והתחתית היא גלולה. הגלולה יופיע אדום כפי שהוא תערובת של תאים אפיתל, בודדים סטרומה תאים, וכדוריות הדם האדומות (איור 1G).
  9. העבר את כל הפיפטות, עצות הפיפטה וצינורות הצנטריפוגה עם התמיסה של סרום השור (BSA) לפני המגע. הפתרון BSA מורכב 2.5 w/v% BSA בתוך מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). לציפוי מראש, פשוט להוסיף ולאחר מכן להסיר פתרון BSA לתוך החלק הפנימי של הצנרת וצינורות. ניתן לעשות שימוש חוזר בפתרון BSA, למרות שהוא אמור להיות מסונן לפני כל ניסוי.
  10. להתאוששות נוספת, להעביר את הסופרנטאנט לצינור BSA טרי מצופה שפופרת 15 mL. פיפטה למעלה ולמטה במרץ כדי לפזר שכבת שומן. צנטריפוגה ב 450 x g עבור 10 דקות ב-RT. ולאחר מכן, מותיר כמות קטנה של מדיה בצינור, כדי להימנע מלבשל את הגלולה הסלולרית.
  11. מנקז את השכבה הימית. מהצינור עם הגלולה המקורית
  12. הוסף 10 מ ל של DMEM/F12 לצינור עם הגלולה המקורית להעביר את הצינור השני. פיפטה במרץ כדי לשלב ולהשעות את שתי החבילות.
  13. צנטריפוגה ב 450 x g עבור 10 דקות ב-RT. משלחים את הסופרנטאנט ומוסיפים 4 מ ג/F12 לצינור.
  14. להוסיף 40 μL של deoxyribonuclease (DNase) אל ההשעיה בעדינות לנער ביד עבור 2-5 דקות ב RT. DNase פתרון מורכב 4 U/mL DNase ב DNASE/F12.
  15. הוסף 6 מ ל של Dמאמ/F12 ו פיפטה ביסודיות. צנטריפוגה את הצינור ב 450 x g עבור 10 דקות ב RT.
  16. . מפני שהוא מסמן את ה0.5 השהה מחדש ב-10 מ ל של Dמאמ/F12 ופיפטה ביסודיות.
  17. דופק 450 x g ולעצור 4 s לאחר שהגיע במהירות זו.
  18. חזור על הצעדים 1.16-1.17 עוד שלוש פעמים כדי לטהר את האורגנואידים באמצעות בידול צנטריפוגלי. הגלולה צריך עכשיו להיות צבע מחוץ ללבן המורכב של רק אורגנואידים אפיתל (איור 1H).
    הערה: אורגנואידים ניתן גם לסנן באמצעות רשת סטרילית 40 יקרומטר מסננים. לאחר שלב 1.16, מדיה פיפטה המכיל אורגנואידים דרך מסנן לתוך שפופרת צנטריפוגה, ולאחר מכן לשטוף עם 5 כדי 10 מ ל של Dמאמ/F12 מדיה. הפוך את המסנן מעל שפופרת צנטריפוגה חדשה 50 mL. העבר 10 מ ל של DMEM דיה/F12 דרך, הולך בדרך הפוכה לשטוף כל רטינטאט. הרטינטאט צריך להיות מורכב מאורגנואידים, והפילטרט צריך להיות מורכב בעיקר של תאים סטרומה, אשר ניתן להיפטר או לשמור במידת הצורך.

2. קביעת צפיפות וציפוי מאורגנואידים

  1. להשעות את הגלולה ב 10 מ ל/F12. פיפטה ביסודיות ליצירת פתרון הומוגנית.
  2. העבר 50 μL ל 30 מ"מ צלחת פטרי, ולהציג תחת מיקרוסקופ הניגודיות שלב ב 20x. תספור את מספר האורגנואידים. עם מונה מספרים
    הערה: הנה טיפים פיפטה שימשו בעקביות עם קוטר מינימלי של 457 μm, וזה 5-10 פעמים קוטר של האורגנואידים כי הם הנזרע. להעברת כרכים של 2 מ ל או יותר (למשל, שלבים 1.16 ו-2.1), יש להשתמש בפיפטות נסיולוגיים עם קצה קוטר של 1,500 μm.
  3. חישוב צפיפות האורגאיד באמצעות המשוואה הבאה:
    Equation
    הצפיפות הרצויה היא 1,000 אורגנואידים/mL כדי לפשט דילול נוסף. אם הצפיפות נמוכה מדי, צנטריפוגה ב 450 x g עבור 5 דקות ומדי התקשורת. הוסף מדיה הדרושים כדי להגיע ל-1,000 אורגנואידים/mL, ופיפטה ביסודיות ליצירת תערובת הומוגנית.
    1. כדי לגדל אורגנואידים במטריצה חלבון, אורגנואידים הזרעים בריכוז של 1 אורגאיד/L בסוג קולגן 1 מדולל 87% או בקרום המרתף שחולצו מ אנגלברth-הולם-סרקומה של העכבר. , בזמן שעבדתי עם דגימות. המשיכו לאכול
    2. כדי להקפיא אורגנואידים, העבר את העוצמה הרצויה לשפופרת צנטריפוגה נפרדת. ספין למטה ב 450 x g עבור 5 דקות. התקשורת ולאחר מכן להוסיף את אותו כמות של 90% fbs/10% dmso. , להשעות את האורגנואידים. ואז להיכנס לקריוצינורות העברה ל-80 ° c ולאחר מכן לחנקן נוזלי בתוך שבוע אחד.
    3. להפשיר, להתחמם באמבט מים ב37 מעלות צלזיוס לדקה אחת. צנטריפוגה ב 450 x g עבור 5 דקות, ולאחר מכן הקפאת מדיה הקפאה. לשטוף עם DPBS סטרילי, ולאחר מכן צנטריפוגה שוב. . ולהוסיף מדיה ארגונית
  4. פיפטה 50 μL (50 אורגנואידים) לתוך כל באר של לוחית הדבקה נמוכה (איור 1I).
  5. הוסף 150 μL של מדיה ארגונית כדי להביא את נפח העבודה הכולל ל 200 μL. אורגנואיד מדיה מורכב 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-1% אינסולין-הועבר-סלניום (שלה) ב-Dמאמ/F12 מדיה.
  6. כל יומיים מחליפים את המדיה בקפידה.
    הערה: לוחיות הדבקה נמוכות אינן מטופלות בתרבות הרקמה; לכן, ניתן להתנתק בקלות בתאים. מנושף את התקשורת באיטיות על-ידי הטיית הצלחת והחדרת הקצה של הפיפטה בקצה של כל באר. השאירו כמות קטנה של מדיה בתחתית הבאר. הוסף באיטיות מדיה חדשה כדי להימנע מהחלת כוחות הטיה לא נחוצים לאורגנואידים.

3. Co-culturing עם מקרופאגים

  1. שמור על GFP או dTomato-מקרופאגים RAW 264.7 במדיה DTOMATO בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. Seed 1 x 104, 5 x 104, או 1 x 105 תאים/mL לתוך מדיה ארגונית.
  2. השתמש בניגוד לשלב החי של התאים והדמיה פלואורסצנט לניטור הסתננות מקרופאג לאורך זמן.

4. כתמים מאימונולואורנציה של אורגנואידים

הערה: הארגון יכול להיות מוכתם בבארות הדבקה נמוכות או שניתן להעבירו לשקפים קאמריים. כדי להעביר, הפיפטה בעדינות למעלה ולמטה עד שהאורגנואידים התנתק מלוחות. העברה לשקופיות קאמרית ו-דגירה עבור 4-8 h כדי לאפשר לאורגנואידים לדבוק משטח הצלחת.

  1. הסר את המדיום האורגאידית מבארות על-ידי הסרת האספירין בזהירות. לתקן דגימות עם 10% המאגר ניטרלי באגירה עבור 15 דקות ב RT.
  2. שטוף 3 x 5 דקות ב-1x PBS. במקרה הצורך, ניתן לאחסן דגימות קבועות ב-4 ° צ' למשך שבוע עבור כתמים נוספים.
  3. החדירות עם 0.1% 4-(1, 1, 3, 3-טטרמתיבוטיל) פניאיל-פוליאתילן גליקול 5 דקות.
    הערה: כדי להכתים את F-actin, מדגמים מודורים עם phalloidin מדולל 1:1000 ו 1.67 ננומטר ביבנזימיד לצבוע גרעינית 1% PBS/BSA עבור 1 h ב RT. . אז, המשך לשלב 4.8
  4. ברימיוז עם 0.5 PBS. דגימות יכולות להיות מאוחסנות בתמונות 4 העתק ותמונות מוחיסורמיות. מנגנונים שתורמים CTC rlock עם סרום עז 5% רגיל ב 0.1% PBS/פוליאתילן גליקול ביתן monolaurate (PBST) עבור 1 h ב RT. לשטוף את 3x 5 דקות עם PBS.
  5. דגירה עם אנטי ציטוקרטין 14 מדולל 1:1000, E-קדהרין מדולל 1:200, או הדוקה החלבון הצומת 1 מדולל 1:100 ב 1% NGS ב PBST עבור 1 h ב RT. לשטוף את 3x 5 דקות ב PBST.
  6. דגירה עם עז נגד ארנב משני מדולל 1:200 עם 1% NGS/PBST עבור 1 h ב RT. לכסות עם נייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור.
  7. שטוף 3 x 5 דקות ב-PBS. השתמש בצבע הגרעיני (ראה טבלת חומרים) כדי להכתים גרעינים.
  8. שטוף 3 x 5 דקות ב-PBS. , אם אתה משתמש במגלשה. הר עם שמיכות החנות עטופה בנייר כסף ב -4 ° c עד שבועיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בלוטות החלב שנחשפו לקרינה התקבלו בהצלחה מבלוטות החלב של העכבר, מעובדות ומתרבות על לוחות הדבקה נמוכה (איור 1). תשואה אורגאיד נבדקה על ידי זריעה בסביבות גידול שונות (איור 2A-G). זורעי תאים ישירות על תרבות רקמות שטופלו 10 ס מ לוחות התא הניבו צמיחה יתר של תאים פיברובסט. המיקרותקיעות זוהו תחת מיקרוסקופ לעומת הפאזה או בסמוך לאותו מישור של מיקוד, והם גדלו במהירות מאורגנואידים מצופים תוך ימים ספורים. הצמיחה של פיברותקיעות נצפתה גם כאשר אורגנואידים היו הנזרע קרום המרתף מטריצות חלבון קולגן (איור 2E, F).

מגוון רחב של תנאים נבדקו באופטימיזציה של צמיחה אורגאידית הקרינה (איור 2H). כאשר אתם משתמשים בסוג זה של הארגון, שימשו כאנזים בשלב העיכול12,16,17. תשואות אורגנואיד היו גבוהות באופן משמעותי לאחר העיכול עם כוליוגנאז VIII. זה יכול להיות בגלל תהליכי טיהור המשמשים להפקת האנזים: קולגן סוג אני מטוהר חלקית עלול לגרום נזק מיותר חלבונים וקולטנים קרום, המוביל היווצרות אורגאיד עניים, לפירוק תאים, או העיכול מעל16 , מיכל בן 17 , 18. לא נצפו הבדלים משמעותיים בתפוקה בין האורגנואידים לקרינה שבבקרה.

אורגנואידים לקרינה יכול להיות מתורבת לוחיות הדבקה נמוכות (איור 3A-C) או בתוך קרום המרתף (איור 3A-G), אבל הצמיחה המהירה ביותר התרחשה לוחיות הדבקה נמוכה (איור 3a). אורגנואידים מאחד את המאפיינים של בלוטת החלב. ראשי חץ לבנים מצביעים על בנייה מורפולוגית בדומה לצינוריות ולאונות19, 20,21 (איור 3c), הקריטיים לייצור והובלת חלב בבלוטת הפטמות21. עם זאת, נדרש אפיון נוסף כדי לאשר התבוננות זו. מגמות גדילה הראו כי אורגנואידים שאינם מוקרן לקרינה גדל מהר יותר מאשר אורגנואידים הקרינה (איור 3H), סביר להניח בשל המעצר צמיחת תאים כתוצאה ממנגנונים של תיקון DNA נזק; עם זאת, המגמה לא היתה משמעותית מבחינה סטטיסטית22. מזדמנים לעתים של מארגני הדבקה נמוכה נצפתה, ו אורגנואידים יכול להיות מתורבת עד שבועיים לפני הנתק.

אורגנואידים הביע מאפיינים אפיתל, אשר הוערכו באמצעות כתמים immunofluorescence של ציטוקרטין 14 (K14), e-קדהרין (ה-cad), ו חלבון צומת צר 1 (ZO-1)23,24,25 ( איור 4). אורגנואידים שעברו קרינה. הביעו סמנים אפיתל K14, סמן של מיואפיתל23, הביע בחוזקה על פני השטח של אורגנואידים הקרינה (איור 4a). בנוסף, E-cad ו-ZO-1 ביטאו בתוך הצמתים הסלולריים של אורגנואידים (איור 4B, C). חלבונים אלה חיוניים תאים הדבקה נכונה24. לאחר ההקרנה, אורגנואידים המשיך לשמור על התכונות האפיתל שלהם.

כתמים פלואורסצנטי של אורגנואידים יכול להיות דמיינו בתוך לוחיות הדבקה נמוכות באמצעות מיקרוסקופ קרינה (איור 5A-D); עם זאת, ההדמיה הברורה ביותר הושגה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי (איור 5e-F). עוצמת הזריחה הכוללת המתוקנת חושבה על-ידי הפחתת הרקע ונרמול באמצעות אזור אורגנואיד (איור 5G). מארגני גידול ב96-היטב לוחיות הדבקה נמוכות גם הן ניסויים מפושטת של תרבות ושיתוף. כאשר הנזרע בריכוזים אופייניים בלוטת החלב, מקרופאגים מקומיים עם שליטה ואורגנואידים הקרינה (איור 6)24,26.

Figure 1
איור 1. זרימת עבודה של פעולת שירות. (א) בלוטות החלב הרגע המריאו מעכברים. בלוטות החלב והבטן והאינרינלים שימשו. (ב) בלוטות החלב הוקרן בשנת 50 mL בצינורות צנטריפוגה המכילים מדיה dmem/F12. (ג) בלוטות החלב הועברו לצלחות בנות שש-היטב, ונחתכו באזמל כירורגי עד שהוא היה כתוש (D). (ה) בלוטות החלב הועברו לצינורות צנטריפוגה 50 mL המכיל 5 מ ל של מדיה סטרילית Dמאמ/F12 לכל בלוטה מתעכל בתמיסה השמיני של קולגן (F). (G) לאחר העברת הצינור 15 מ"ל, בידול צנטריפוגלי היה מנוצל כדי להסיר תאים סטרומה, תאים בודדים, וכדוריות הדם האדומות, נצפתה כדור אדום (לבן החץ-ראש) עד רק אורגנואידים לבנים הושגו (H ). (I). 50 אורגנואידים היו מצופים 200 μl של מדיה ב 96-היטב לוחיות הדבקה נמוכות ובאמצעות התמונה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה בר מייצג 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. ציפוי אורגאיד בתוך מטריצות חלבון תלת ממדי ובתרבית רקמה מטופלת פלסטית. אורגנואידים שופרה קולגן (א) ו קרום המרתף (ב), התמונה לאחר 84 שעות של צמיחה. צמיחת הגידול של הפיברואידים התרחשה באורגנואידים מוזהבים (C, D). תמונות חדות פאזה של אורגנואידים מיון באמצעות סינון הושגו 192 שעות לאחר זריעת. אין הבדלים משמעותיים בין הפילטרט (E) ו רטיט (F) נצפו, עם שניהם כתוצאה מכך הצמיחה שוטפת פיברוהגל. תאים E ו- F הופרה על תרבות רקמה מטופלים פלסטיק. לאחר טריסינטזציה למשך 5 דקות בשעה RT, הוסרו הפיברוכדורים באמצעות שאיפה; עם זאת, תאים אפיתל שנותרו יצרו תרבות מונאולייר במקום אורגנואידים תלת מימדי (G). סרגלי קנה מידה עבור A-G מייצגים 100 μm. (H) סוגים שונים של הקולגן (אני (CI) ו-VIII (cviii)) ושיטות עיבוד תאים (סינון ובידול צנטריפוגלי (סנט Diff)) נבדקו, ותשואה אורגאידית לכל בלוטת החלב היתה כימות (n = 2 בלוטות עבור CI, מסנן; 2 בלוטות עבור CVIII, מסנן; 4 בלוטות עבור CI, סנט Diff, ו 12 בלוטות עבור CVIII, סנט Diff). המשמעות הסטטיסטית נקבעה באמצעות דו-זנבי, לא מזווג-t-מבחן, * * * p < 0.0001. קווי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. . צמיחה ארגונית מייצגת תמונות חדות פאזה של גידול אורגנואיד לקרינה בצלחות הדבקה נמוכות הושגו 20 (א), 44 (ב) ו-106 (ג) שעות לאחר זריעה. ראשי חץ לבנים מצביעים על מבנים בעלי מורפולוגיה דומה לתעלות ולאונות. הניגודיות הפאזה תמונות של גידול אורגנואיד לקרינה בתוך קרום המרתף המתקבל 42 (ד), 66 (E), 60 (F), ו 114 (ז) שעות לאחר זריעה. סרגלי קנה מידה מייצגים 50 μm. H. מדידות שטח הושגו בתנאי גדילה שונים: אורגנואידים הנזרע מיד לאחר עיכול ומיון (הקרינה (●), בקרה (▪)), ו אורגנואידים שנזרע קרום המרתף (הקרינה (○), בקרה (□)) (n = 3 בלוטות כל אחד). חישובי שטח נעשו באמצעות תוכנת ImageJ. קווי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. ביטוי אפיתל מרקר על אורגנואידים קרינה. ציטוקרטין 14 (K14, ירוק), סמן עבור שכבת הבסיס של קשקש ו epithelia, התבטא על אורגנואידים הקרינה (א). E-קדהרין (E-Cad), חלבון חיוני להדבקה, התבטא בתוך הצמתים שבין התאים באורגנואידים שעברו הקרינה (ב). חלבון הצומת הדוקה אחד (ZO-1) התבטא גם בתוך צמתי תאים של אורגנואידים הקרינה (C). התמונות הושגו בשקפים קאמריים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. הכתם חומצת גרעין שימש להמחיש גרעינים (כחול). כל האורגנואידים תוקנו והינם מתוקנים לאחר שבוע של צמיחה. סרגלי קנה מידה הם 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5. . ביטוי F-אקטין באורגנואידים F-actin (אדום), מיקרופילמנט בתאי אפיתל, התבטא בעוצמה נמוכה יותר באורגנואידים שאינם מקרינה (a, C, E) מאשר בתוך הקרינה (B, D, F) אורגנואידים. הכתם חומצת גרעין שימש להמחיש גרעינים (כחול). תמונות צולמו על הדבקה נמוכה 96-טוב צלחות (A, B) ו 16-היטב שקופיות קאמרית (C, D). התמונות נלקחו גם באמצעות מיקרוסקופ קונסקופיה (E, F). כל האורגנואידים תוקנו והינם מתוקנים לאחר שבוע של צמיחה. פסי קנה מידה הם 50 μm. G. Phalloidin הנתונים הפלואורסצנטית מתמונות לוחית הדבקה נמוכה היו כמותית ב-ImageJ (n = 3 בלוטות). קווי שגיאה מציינים שגיאה סטנדרטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6. הערכת אינטראקציות של תאי תא באמצעות תרבות שיתוף מקרופאג-אורגנואיד. מקרופאגים (אדום) חדרו לבקרה (A) ולקרינה (ב) אורגנואידים. סרגלי קנה מידה מייצגים 50 μm. ממוצע אחוז השטח של מקרופאגים בשדה התמונה (C) דווח 24 שעות של תרבות שיתוף עבור שליטה (צהוב) ו לקרינה (כתום) אורגנואידים (n = 3 בלוטות לכל מדגם). מקרופאגים היו שופרה בריכוזים של 10,000 תאים/mL, 50,000 תאים/mL, ו 100,000 תאים/mL, חדירה שלהם היה לכוד כל 30 דקות באמצעות הדמיה של תאים לחיות הדמיית. כל הניסויים שיתוף התרבות החלה 7 ימים לאחר זריעה ראשונית אורגאידית. מובהקות סטטיסטית נקבע באמצעות דו-זנבית, מבחן t מזווג, * p < 0.05, * * * p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה פיתחנו שיטה לצמיחה ואפיון של מארגני הפטמות הקרינה (איור 1). מינון הקרנה של 20 Gy הוחל על מראה הקודם במודלים vivo של הזרקור של תא הגידול5. הקרנה של בלוטות החלב לשעבר vivo לפני היווצרות אורגאיד מותר לבידוד של אפקטי נזק קרינה ללא חדירה מתאימה של תאים חיסוניים. התפתחות של מודל רקמה נורמלית לקרינה מחוץ לתמונה מאפשרת צפייה בזמן אמת של אינטראקציות סלולר שעשויות לתרום CTC גיוס המושרה11,12.

הצעדים הבאים של 1.5-1.18 היה קריטי להגדלת התשואה האורגאידית. הוספנו לפתרון העיכול. בשל האופי הצמיגי ביותר של הקולגן מרוכז, יכול להיות כמה וריאציות בסכום ולכן בפעילות אנזימטית, כך העיכול אורגאיד חייב להיות מפוקח הדוק כדי למנוע עיכול מעל. חשוב גם לעכל אורגנואידים בצינור 50 mL כמו זה מאפשר לשטח משטח אפילו לעיכול. מחקרים אחרים השתמשו בסינון לטיהור אורגנואידים19,23; עם זאת, הצלחנו להשיג תשואה גבוהה יותר לטיהור עם בידול צנטריפוגלי (איור 2H). פיפטות לציפוי, טיפים לפיפטה, וצינורות צנטריפוגה עם פתרון BSA חיוניים להגדלת התשואה. אורגנואידים באופן ניכר לדבוק פלסטיק בלתי מצופה כאשר יישום הפתרון הוא מוזנח.

יש לנקוט בזהירות רבה כדי להימנע מלקיחת מנינואידים. זהו סיכון המתרחש בעת טיהור, שינוי מדיה וכתמים עבור סמני פלורסנט. באמצעות לוחות הדבקה נמוכה לצמיחה מאפשר העברה קלה של אורגנואידים ומסיר את הצורך אורגנואידים להיות מנות ב OCT עבור כתמים נוספים, הליך נדרש עבור קרום מרתף מוטבע אורגנואידים11. בנוסף היתרונות של צמיחה מעולה, זריעת הקרינה הוקרן בלוחות הדבקה נמוכה נדרש פחות צעדים והיה פחות מאתגר מבחינה טכנית מאשר בקרום המרתף או קולגן. עם זאת, בעת צביעת סמנים, ייתכן שיהיה שימושי לראות אורגנואידים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח כי שאיפה מקרית לא מתרחשת.

יתרה מזאת, ישנם שיקולים רבים שיש להתייחס אליהם כאשר הדמיה ממוחשבת. בתוך קרום המרתף אורגנואידים מוטבע, צמיחה מזדמנים הפיצוץ עשוי להיות נצפתה (איור 2C, D). הצמיחה פיברובלסט ב-3D מאורגנואידים תרבותית עשוי להיגרם על ידי אורגנואידים ליצור קשר עם תרבות רקמת משטח מטופלים כמו הדבקה מוביל לייצור הצמיחה פיברובטין הגידול בתאי חסיד27. מעניין, המבנה של הפיברותקיעות האלה הוא באופן מפתיע דומה מראש-adipocytes כמו שני סוגי תאים מוצג באופן מוארך, צורות מאורכים28. בחקירה נוספת, חשיפה לאינסולין, dexamethone, ו-3-isobutyl וטיל-1-מתילקסאתה (IBMX) עשוי להניב תאים עם השושלת האדיגנית, להתאים משמרת לכיוון הצורה התאית יותר כדורית הקשורים adipogenic28, 29. הצלחנו להשיג תמונות ברורות באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה של הדבקה ללא הגדלה (איור 3a-C) ו קרום המרתף מוטבע (איור 3a-G) אורגנואידים. מעקב אחר צמיחה ארגונית בודדים בלוחות הדבקה נמוכה, עם זאת, היה קשה בשל הידקויות מיקוד מינימלי בין תאים ומשטח טוב, וכתוצאה מכך תנועה ארגונית ושאיפה מדי פעם.

לאחר הכתם על סמני פני השטח, מיקרוסקופיה קונפוקלית שניתנו לוקליזציה של סמן ברור יותר (איור 5E, F) ממיקרוסקופ שטח (איור 5e-D). מתוך כימות הקרינה הפלואורסצנטית, מגמות בביטוי phalloidin מראים כי אורגנואידים הקרינה הביע מוגברת F-actin ביחס לפקד (איור 5G). Actin הארגון התארגנות מחודש נצפתה בתאי מיקרוכלי העורי הקרינה הוקרן במינונים דומים30.

עבור רצפי הדמיה מורחבת, כמו לשגות בזמן תרבות שיתוף עם תאים חיסוניים (איור 6), תא הדמיה לחיות חדר עם לחות ו-co2 שליטה נדרש31. תמונות התאים החיים שנלקחו כל 30 דקות גילה כי מקרופאגים מקומיים עם אורגנואידים לאחר 24 שעות (איור 6A, B), מעדיפים לעבור לעבר אורגנואידים הקרינה (איור 6a). מקרופאג הסתננות לתוך רקמת הקרינה הרגילה נצפתה בvivo, מיוחס כימוקין ו ציטוקינים מעברי הצבע, ובדרך כלל לפני CTC גיוס5. מחקרים עתידיים יהיה להעריך קלאסי לחילופין מופעל אינטראקציות מקרופאג עם אורגנואידים כמו מקוטב מקרופאג dynamics עשוי לשחק תפקיד חשוב בקביעת תגובה קרינה32,33. ניתוחים נוספים יעריכו את התוצאה של הרעבה בסרום ואת השפעות הצמיחה של האורגנואידים של culturing במדיה המלאה מאז משתנים אלה עשויים להיות השפעות משמעותיות על האינטראקציות של תאים החיסונית. מערכת זו יכולה עוד להיות מותאם עבור שיתוף תרבות עם סוגי תאים אחרים, כולל CD8 + T תאים, סטרומה תאים, adipocytes, ותאי סרטן השד. התבוננות בזמן אמת עם טכניקות כמו הדמיה תא חי יקל על ההתבהרות של מנגנונים פוטנציאליים שתורמים לגיוס CTC לרקמות נורמלי לקרינה, אשר עשויים להיות השלכות משמעותיות עבור חולים הסובלים מפני חוזרים . אן-בי-סי

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים ד ר לורה ל. ברוסארט עבור מתן GFP ו-dTomato התווית RAW 264.7 מקרופאגים. מחקר זה היה נתמך כספית על ידי מלגת NIHR00CA201304.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Neutral Buffered Formalin VWR 16004-128
Anti-cytokeratin 14 abcam ab181595 Lot: GR3200524-3
Bovine Serum Albumin Sigma A1933-25G
Collagen Type I Corning 354236
Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII Sigma C2139
Collagenase I Gibco 17018029
DMEM/F12 Thermofisher 11320-033
DNAse Roche 10104159001
DPBS Fisher 14190250
E-Cadherin Cell Signaling 24E10 Lot: 13
FBS Sigma F0926
Gentamicin Gibco 15750
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150077 green
Lot: GR3203000-1
Goat anti-rabbit secondary abcam ab150080 red
Lot: GR3192711-1
Hoechst 33342 Fisher 62249 Lot: TG2611041
Insulin (10 mg/mL) Sigma I9278
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x Gibco 51500-056
Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma) Corning 356237
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000
Nuclon Sphera 96 well plates Thermo 174927
PBS VWR 10128-856
Pen/strep Fisher 15140122
Phalloidin abcam ab176757 Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1 Novus NBP1-85047 Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol) Sigma X100-100ML
Trypsin Gibco 27250-018
Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate) Sigma P1379-100ML

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
  2. Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
  3. Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  4. Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
  5. Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).
  6. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  7. Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).
  8. Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
  9. Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
  10. Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
  11. Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
  12. Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
  13. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
  14. DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
  15. Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
  16. Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
  17. Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
  18. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
  19. Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
  20. Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
  21. Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
  22. Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  23. LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  24. Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
  25. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
  26. Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).
  27. Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from: http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract (1989).
  28. Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
  29. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  30. Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
  31. Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
  32. Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
  33. Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).

Tags

ביו-הנדסה סוגיה 147 תרבות ארגונית תלת-ממדית בלוטת החלב תגובה לקרינת העור הנורמלית אינטראקציות תא תאים סרטן השד אימונולוגיה של סרטן
צמיחה ואפיון של אורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hacker, B. C., Gomez, J. D.,… More

Hacker, B. C., Gomez, J. D., Batista, C. A. S., Rafat, M. Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands. J. Vis. Exp. (147), e59293, doi:10.3791/59293 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter