دراسة آثار إشعاع الأنسجة الطبيعية باستخدام هيدروجيلات مصفوفة خارج الخلية
Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة لإزالة الخلايا وتشكيل هيدروجيل لاحق من منصات الدهون الثديية المورين بعد التشعيع خارج الجسم الحي.
Abstract
الإشعاع هو علاج للمرضى الذين يعانون من سرطان الثدي السلبي الثلاثي. تأثير الإشعاع على المصفوفة خارج الخلية (ECM) من أنسجة الثدي السليمة ودورها في تكرار المحلية في موقع الورم الرئيسي غير معروف. هنا نقدم طريقة لإزالة الخلايا، التحلل، وتصنيع هيدروجيلات ECM المستمدة من منصات الدهون الثديية المورين. وتُعرض النتائج المتعلقة بفعالية عملية إزالة الخلايا، وجرى تقييم بارامترات الريولوجية. أظهرت خلايا سرطان الثدي التي تحمل اسم GFP وluciferase والمغلفة في الهيدروجيلات زيادة في الانتشار في المواد المائية المشععة. وأخيرا، تم استخدام تلطيخ المترافق phalloidin لتصور تنظيم الهيكل الخلوي للخلايا السرطانية المغلفة. هدفنا هو تقديم طريقة لتلفيق هيدروجيلات للدراسة في المختبر التي تحاكي في بيئة أنسجة الثدي في الجسم الحي واستجابتها للإشعاع من أجل دراسة سلوك الخلايا السرطانية.
Introduction
يتميز السرطان بالانتشار الزائد للخلايا التي يمكن أن تهرب من المبرمج وأيضا تنتشر إلى مواقع بعيدة1. سرطان الثدي هو واحد من الأشكال الأكثر شيوعا بين الإناث في الولايات المتحدة، مع ما يقدر ب266،000 حالة جديدة و 40،000 حالة وفاة في عام 20182. وهناك عدوانية بشكل خاص وصعبة لعلاج النوع الفرعي هو سرطان الثدي السلبي الثلاثي (TNBC)، الذي يفتقر إلى مستقبلات الإستروجين (ER)، مستقبلات البروجسترون (PR)، وعامل نمو البشرة البشرية (HER2). يستخدم العلاج الإشعاعي عادة في سرطان الثدي للقضاء على الخلايا السرطانية المتبقية بعد استئصال الورم، ولكن أكثر من 13٪ من مرضى TNBC لا تزال تواجه تكرار في موقع الورم الأولي3.
ومن المعروف أن العلاج الإشعاعي فعال في التخفيف من الانبثاث والتكرار لأن الجمع بين استئصال الورم والإشعاع يؤدي إلى نفس البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل مثل استئصال الثدي4. ومع ذلك، فقد ثبت مؤخرا أن العلاج الإشعاعي يرتبط مع تكرار المحلية إلى موقع الورم الأولي في إعدادات المناعة5،6. أيضا، فمن المعروف جيدا أن الإشعاع يغير المصفوفة خارج الخلية (ECM) من الأنسجة الطبيعية عن طريق تحفيز التليف7. لذلك، من المهم فهم دور التغيرات التي يسببها الإشعاع ECM في إملاء سلوك الخلايا السرطانية.
وقد استخدمت الأنسجة منزوعة الخلايا كما في نماذج المختبر لدراسة المرض8،9. هذه الأنسجة منزوعة الخلايا الحفاظ على تكوين ECM وتلخيص المجمع في الجسم الحي ECM. هذه الأنسجة منزوعة الخلايا ECM يمكن معالجتها وهضمها لتشكيل هيدروجيلات ECM المعاد تشكيلها التي يمكن استخدامها لدراسة نمو الخلايا والوظيفة10،11. على سبيل المثال، تم استخدام هيدروجيل اتّممكن مشتق ة من يبأال بشري منزوع الخلايا ومن أنسجة عضلة القلب كأساليب غير غازية لهندسة الأنسجة، كما تم استخدام هيدروجيل مشتق من أنسجة الرئة البورسينية كطريقة اختبار في المختبر [mesenchymal] [سستم سلّ] ملحق وجدوى12,13,14. ومع ذلك، لم يتم التحقيق في تأثير الضرر الإشعاعي للأنسجة الطبيعية على خصائص ECM.
هيدروجيلات مشتقة من ECM لديها أكبر الإمكانات للدراسة في المختبر من الظواهر في الجسم الحي. وقد درست العديد من المواد الأخرى، بما في ذلك الكولاجين، الفيبرين، وmatrigel، ولكن من الصعب تلخيص تركيبة ECM13صناعيا. ميزة استخدام هيدروجيلات مشتقة من ECM هو أن ECM يحتوي على البروتينات اللازمة وعوامل النمو لأنسجة معينة14،15. يؤدي تشعيع الأنسجة الطبيعية أثناء استئصال الورم إلى تغييرات كبيرة في إدارة المحتوى في المؤسسة، ويمكن استخدام المواد المائية المشتقة من ECM لدراسة هذا التأثير في المختبر. هذا الأسلوب يمكن أن يؤدي إلى نماذج أكثر تعقيدا وأكثر دقة في المختبر من المرض.
في هذه الدراسة، أخضعنا منصات الدهون الثديية المورين (MFPs) للإشعاع السابق في الجسم الحي. تم إزالة الخلايا من الـ MFPs وتحويلها إلى حل ما قبل الجل. تم تشكيل هيدروجيلز مع الخلايا 4T1 جزءا لا يتجزأ، خط خلية Murine TNBC. تم فحص الخصائص الريولوجية لمادة هيدروجيل، وتم تقييم ديناميات الخلايا السرطانية داخل هيدروجيلز. هيدروجيلز ملفقة من الملوثات المتعددة الجنسيات المشعة تعزيز انتشار الخلايا السرطانية. وستتضمن الدراسات المستقبلية أنواع خلايا أخرى لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية في سياق تكرار السرطان بعد العلاج.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه الطريقة لتشكيل هيدروجيل تعتمد إلى حد كبير على كمية الأنسجة البداية. الملوثات المتوسطة المتوسطة Murine صغيرة، وعملية إزالة الخلايا يؤديإلى انخفاض كبير في المواد (الجدول 1). ويمكن تكرار هذه العملية مع المزيد من الملوثات الصغرى لزيادة الغلة النهائية. الطحن هو خطوة هامة أخرى قد تؤدي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون الدكتورة لورا ل. برونسارت على توفير خلايا GFP- وluciferase-4T1، والدكتور إدوارد ل. لاغوري للحصول على المشورة بشأن 1—(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol تلطيخ، والدكتور كريغ ل. دوفال لIVIS واستخدام الليوفيليس، والدكتور سكوت أ. غيلشر لrheometer استخدام. وقد حظي هذا البحث بدعم مالي من #R00CA201304 منحة المعهد الوطني للصحة.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | – |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | – |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | – |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | – |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | – |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | – |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | – |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | – |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | – |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | – |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | – |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | – |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | – |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | – |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | – |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | – |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | – |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | – |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
- Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
- Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
- Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
- Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
- Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
- Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
- Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
- Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).
