Het bestuderen van normale weefsel straling effecten met behulp van extracellulaire matrix hydrogels
Summary
Dit protocol presenteert een methode voor decellularisatie en daaropvolgende hydrogel vorming van muriene borst vetpads na ex vivo bestraling.
Abstract
Straling is een therapie voor patiënten met drievoudige negatieve borstkanker. Het effect van straling op de extracellulaire matrix (ECM) van gezonde borstweefsel en haar rol in lokale herhaling op de primaire tumor site zijn onbekend. Hier presenteren we een methode voor de decellularisatie, lyofilisatie en fabricage van ECM-hydrogels die zijn afgeleid van Murine-vetpads. Resultaten worden gepresenteerd over de effectiviteit van het decellularisatie proces, en reologische parameters werden beoordeeld. GFP-en Luciferase-gelabelde borstkankercellen die in de hydrogels zijn ingekapseld, toonden een toename van proliferatie in bestraalde hydrogels. Tot slot, phalloidin geconjugeerde kleuring werd gebruikt om cytoskelet organisatie van ingekapselde tumorcellen te visualiseren. Ons doel is om een methode voor het vervaardigen van hydrogels voor in vitro onderzoek dat nabootsen van de in vivo borstweefsel omgeving en haar reactie op straling te presenteren om tumor cel gedrag te bestuderen.
Introduction
Kanker wordt gekenmerkt door overmatige proliferatie van cellen die apoptosis kunnen omzeilen en ook metastaseren naar verre sites1. Borstkanker is een van de meest voorkomende vormen onder vrouwtjes in de VS, met naar schatting 266.000 nieuwe gevallen en 40.000 sterfgevallen in 20182. Een bijzonder agressief en moeilijk te behandelen subtype is drievoudige negatieve borstkanker (TNBC), die geen oestrogeen receptor (ER), progesteron receptor (PR) en humane epidermale groeifactor (HER2) mist. Radiotherapie wordt vaak gebruikt bij borstkanker om residuele tumorcellen na lumpectomie te elimineren, maar meer dan 13% van de TNBC-patiënten ervaart nog steeds een recidief bij de primaire tumor locatie3.
Het is bekend dat radiotherapie effectief is in het verzachten van metastase en herhaling, omdat de combinatie van lumpectomie en straling in dezelfde lange termijn Overleving resulteert als mastectomie4. Echter, het is onlangs aangetoond dat bestraling wordt geassocieerd met lokale herhaling van de primaire tumor site in immuungecompromitteerde instellingen5,6. Ook is het bekend dat straling de extracellulaire matrix (ECM) van normaal weefsel verandert door fibrose7te induceren. Daarom is het belangrijk om te begrijpen van de rol van straling-geïnduceerde ECM veranderingen in het diceren van tumor Celgedrag.
Decellularized weefsels zijn gebruikt als in vitro modellen om de ziekte te bestuderen8,9. Deze decellularized weefsels behouden ECM-samenstelling en recapituleren het complex in vivo ECM. Deze decellularized weefsel-ECM kan verder worden verwerkt en verteerd om gereconstitueerde ECM-hydrogels te vormen die kunnen worden gebruikt om celgroei en functie10,11te bestuderen. Bijvoorbeeld, injecteerbare hydrogels afgeleid van decellularized humaan lipoaspiraat en van myocard weefsel diende als niet-invasieve methoden van weefsel engineering, en een hydrogel afgeleid van varkens longweefsel werd gebruikt als een in vitro testmethode mesenchymale stamcel bevestiging en levensvatbaarheid12,13,14. Het effect van normale beschadiging van de weefsel straling op de ECM-eigenschappen is echter niet onderzocht.
Hydrogels afgeleid van ECM hebben het grootste potentieel voor in vitro onderzoek naar in vivo verschijnselen. Er zijn verschillende andere materialen bestudeerd, waaronder collageen, fibrin en matrigel, maar het is moeilijk om de samenstelling van de ECM13synthetisch te recapituleren. Een voordeel van het gebruik van ecu-afgeleide hydrogels is dat de ECM de nodige eiwitten en groeifactoren voor een bepaald weefsel14,15bevat. Bestraling van normaal weefsel tijdens lumpectomie veroorzaakt significante veranderingen in de ECM, en de ECM-afgeleide hydrogels kunnen worden gebruikt om dit effect in vitro te bestuderen. Deze methode kan leiden tot meer complexe en nauwkeurigere in vitro modellen van ziekte.
In deze studie hebben we Murine borst Fat pads (mfp’s) blootgesteld aan straling ex vivo. De Mfp’s waren decellularized en gemaakt in pre-gel oplossing. Hydrogels werden gevormd met ingesloten 4T1 cellen, een Murine TNBC cellijn. De Rheologische eigenschappen van het hydrogel materiaal werden onderzocht en de tumor celdynamiek werd geëvalueerd binnen de hydrogels. Hydrogels vervaardigd van bestraalde Mfp’s verbeterde tumor celproliferatie. Toekomstige studies zullen omvatten andere celtypen om celcelinteracties te bestuderen in de context van herhaling van kanker na therapie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode van hydrogel vorming is grotendeels afhankelijk van de hoeveelheid start weefsel. Murine Mfp’s zijn klein en het decellularisatie proces resulteert in een significante reductie van materiaal (tabel 1). Het proces kan worden herhaald met meer Mfp’s om de uiteindelijke opbrengst te verhogen. Frezen is een andere belangrijke stap die kan leiden tot verlies van materiaal. Anderen hebben succes getoond met een cryogene molen, maar dit protocol is gebaseerd op frezen via een handheld mortel en ele…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. Laura L. bronsart voor het leveren van de GFP-en Luciferase-4t1 cellen, Dr. Edward l. lagory voor advies over 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo) -2-naphthol kleuring, Dr. Craig L. Duvall voor ivis en lyofilisator gebruik, en Dr. Scott A. guelcher voor rheometer Gebruiken. Dit onderzoek werd financieel gesteund door NIH Grant #R00CA201304.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | – |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | – |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | – |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | – |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | – |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | – |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | – |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | – |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | – |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | – |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | – |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | – |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | – |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | – |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | – |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | – |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | – |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | – |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
- Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
- Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
- Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
- Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
- Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
- Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
- Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
- Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).
