Estudio de los efectos de radiación de tejido normal con hidrogeles de matriz extracelular
Summary
Este protocolo presenta un método para la descelularización y posterior formación de hidrogel de almohadillas de grasa mamaria murina después de la irradiación ex vivo.
Abstract
La radiación es una terapia para pacientes con cáncer de mama triple negativo. Se desconoce el efecto de la radiación en la matriz extracelular (ECM) del tejido mamario sano y su papel en la recurrencia local en el sitio del tumor primario. Aquí presentamos un método para la descelularización, liofilización y fabricación de hidrogeles ECM derivados de almohadillas de grasa mamaria murina. Se presentan resultados sobre la eficacia del proceso de descelularización, y se evaluaron los parámetros reológicos. Las células de cáncer de mama etiquetadas por GFP y luciferasse encapsuladas en los hidrogeles demostraron un aumento de la proliferación en hidrogeles irradiados. Finalmente, se empleó la tinción conjugada con phalloidin para visualizar la organización del citoesqueleto de las células tumorales encapsuladas. Nuestro objetivo es presentar un método para la fabricación de hidrogeles para el estudio in vitro que imitan el entorno del tejido mamario in vivo y su respuesta a la radiación con el fin de estudiar el comportamiento de las células tumorales.
Introduction
El cáncer se caracteriza por la proliferación excesiva de células que pueden evadir la apoptosis y también hacer metástasis en sitios distantes1. El cáncer de mama es una de las formas más comunes entre las mujeres en los Estados Unidos, con un estimadode 266.000 nuevos casos y 40.000 muertes en 2018 2. Un subtipo particularmente agresivo y difícil de tratar es el cáncer de mama triple negativo (TNBC), que carece del receptor de estrógeno (ER), el receptor de progesterona (PR) y el factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). La radioterapia se utiliza comúnmente en el cáncer de mama para eliminar las células tumorales residuales después de la tumorectomía, pero más del 13% de los pacientes con TNBC todavía experimentan recurrencia en el sitio primario del tumor3.
Se sabe que la radioterapia es eficaz para mitigar la metástasis y la recurrencia porque lacombinación de lumpectomía y radiación da como resultado la misma supervivencia a largo plazo que la mastectomía 4. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que el tratamiento de radiaciónestá asociado con la recurrencia local al sitio del tumor primario en entornos inmunocomprometidos 5,6. Además, es bien sabido que la radiación cambia la matriz extracelular (ECM) del tejido normal induciendo la fibrosis7. Por lo tanto, es importante entender el papel de los cambios de ECM inducidos por la radiación en la dictación del comportamiento de las células tumorales.
Los tejidos descelularizados se hanutilizado como modelos in vitro para estudiar la enfermedad 8,9. Estos tejidos descelularizados preservan la composición de la ECM y recapitulan el complejo in vivo ECM. Este eCM de tejido descelularizado se puede procesar y digerir para formar hidrogeles ECM reconstituidos que se pueden utilizar para estudiar el crecimiento celular y la función10,11. Por ejemplo, los hidrogeles inyectables derivados del lipoaspirato humano descelularizado y del tejido miocárdico sirvieron como métodos no invasivos de ingeniería tisular, y un hidrogel derivado del tejido pulmonar porcino se utilizó como método in vitro de prueba accesorio de células madre mesenquimales y viabilidad12,13,14. Sin embargo, no se ha investigado el efecto del daño normal por radiación tisular en las propiedades de ECM.
Los hidrogeles derivados de ECM tienen el mayor potencial para el estudio in vitro de fenómenos in vivo. Se han estudiado otros materiales, incluyendo colágeno, fibrina y matrigel, pero es difícil recapitular sintéticamente la composición del ECM13. Una ventaja del uso de hidrogeles derivados de ECM es que el ECM contiene las proteínas y factores de crecimiento necesarios para un tejido en particular14,15. La irradiación de tejido normal durante la tumorectomía causa cambios significativos en el ECM, y los hidrogeles derivados de ECM se pueden utilizar para estudiar este efecto in vitro. Este método podría conducir a modelos in vitro más complejos y más precisos de la enfermedad.
En este estudio, sometimos almohadillas de grasa mamaria murinos (MFP) a radiación ex vivo. Los equipos multifunción se descelularizaron y se convirtieron en una solución pregel. Los hidrogeles se formaron con células 4T1 incrustadas, una línea celular de TNBC murina. Se examinaron las propiedades reológicas del material hidrogel y se evaluó la dinámica de las células tumorales dentro de los hidrogeles. Los hidrogeles fabricados a partir de equipos multifunción irradiados mejoraron la proliferación de células tumorales. Estudios futuros incorporarán otros tipos de células para estudiar las interacciones células celulares en el contexto de la recurrencia del cáncer después de la terapia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método de formación de hidrogel depende en gran medida de la cantidad de tejido inicial. Las mFP de murine son pequeñas, y el proceso de descelularización da lugar a una reducción significativa del material (Tabla 1). El proceso se puede repetir con más equipos multifunción para aumentar el rendimiento final. El fresado es otro paso importante que puede conducir a la pérdida de material. Otros han demostrado éxito con un molino criogénico, pero este protocolo se basa en</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a la Dra. Laura L. Bronsart por proporcionar las células GFP- y luciferase-4T1, el Dr. Edward L. LaGory por consejos sobre 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol manchación, Dr. Craig L. Duvall para IVIS y uso de liofilizador, y Dr. Scott A. Guelcher para el rheómetro Uso. Esta investigación fue apoyada financieramente por la subvención de los NIH #R00CA201304.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | – |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | – |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | – |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | – |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | – |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | – |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | – |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | – |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | – |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | – |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | – |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | – |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | – |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | – |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | – |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | – |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | – |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | – |
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