Изучение нормальных эффектов радиации тканей с помощью внеклеточных гидрогелей матрицы
Summary
Этот протокол представляет метод для децеллюляризации и последующего гидрогеля формирования murine молочных жировых прокладок после облучения ex vivo.
Abstract
Радиация – это терапия для пациентов с тройным отрицательным раком молочной железы. Влияние излучения на внеклеточную матрицу (ЭКМ) здоровой ткани молочной железы и ее роль в локальном рецидиве на первичном участке опухоли неизвестны. Здесь мы представляем метод децеллюляризации, лиофилизации и изготовления гидрогелей ECM, полученных из murine mammary жировых прокладок. Представлены результаты по эффективности процесса децеллюляризации, оценены реологические параметры. GFP- и люциферазы помечены раковых клеток молочной железы инкапсулированных в гидрогелях продемонстрировали увеличение пролиферации в облученных гидрогелей. Наконец, фаллоидный конъюгированный окрашивание было использовано для визуализации цитоскелетной организации инкапсулированных опухолевых клеток. Наша цель состоит в том, чтобы представить метод для изготовления гидрогелей для исследования in vitro, которые имитируют среду ткани молочной железы in vivo и ее реакцию на радиацию для изучения поведения опухолевых клеток.
Introduction
Рак характеризуется избыточным пролиферацией клеток, которые могут избежать апоптоза, а также метастазировать в отдаленные места1. Рак молочной железы является одной из наиболее распространенных форм среди женщин в США, по оценкам, 266000 новых случаев и 40000 смертей в 2018году 2. Особенно агрессивным и трудным для лечения подтипа является тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC), который не хватает рецепторов эстрогена (ER), рецептор прогестерона (PR), и человека эпидермального фактора роста (HER2). Лучевая терапия обычно используется при раке молочной железы для устранения остаточных опухолевых клеток после lumpectomy, но более 13% пациентов TNBC по-прежнему испытывают рецидив на первичном сайте опухоли3.
Известно, что лучевая терапия эффективна в смягчении метастазирования и рецидивов, поскольку сочетание лампэктомии и радиации приводит к такому же долгосрочному выживанию, как мастэктомия4. Тем не менее, недавно было показано, что лучевая терапия связана с местным рецидивом первичного участка опухоли в условиях иммунокомпромисса5,6. Также хорошо известно, что излучение изменяет внеклеточную матрицу (ЭКМ) нормальной ткани, вызывая фиброз7. Поэтому важно понимать роль вызванных радиацией изменений ЭКМ в диктовке поведения опухолевых клеток.
Децеллюляризованные ткани были использованы вкачестве моделей in vitro для изучения болезни 8,9. Эти децеллюлярные ткани сохраняют состав ECM и резюмируют комплекс in vivo ECM. Эта децеллюляризованная ткань ECM может быть дополнительно обработана и переварена, чтобы сформировать восстановленные гидрогели ECM, которые могут быть использованы для изучения роста клеток и функции10,11. Например, инъекционные гидрогели, полученные из децеллюлярного липоаспиратии человека и из ткани миокарда, служили неинвазивными методами тканевой инженерии, а гидрогель, полученный из ткани свиного легкого, использовался в качестве метода тестирования in vitro мезенхимальных стволовых клеток вложения и жизнеспособности12,13,14. Влияние нормального повреждения тканей радиации на свойства ECM, однако, не было исследовано.
Гидрогели, полученные из ECM, обладают наибольшим потенциалом для изучения in vitro явлений in vivo. Было изучено несколько других материалов, в том числе коллаген, фибрин и матригель, но трудно синтетически резюмировать состав ECM13. Преимущество использования Гидрогелей, полученных из ECM, заключается в том, что ECM содержит необходимые белки и факторы роста для конкретной ткани14,15. Облучение нормальной ткани во время lumpectomy вызывает значительные изменения в ECM, и ECM полученных гидрогелей могут быть использованы для изучения этого эффекта в пробирке. Этот метод может привести к более сложным и более точным в пробирке модели болезни.
В этом исследовании, мы подвергли murine молочных жировых прокладок (MFPs) радиации ex vivo. MFPs были decellularized и сделаны в раствор pre-геля. Гидрогели были сформированы со встроенными 4T1 клетки, линии murine TNBC ячейки. Были изучены реологические свойства гидрогеля, а также оценена динамика опухолевых клеток в гидрогелях. Гидрогели, изготовленные из облученных MFPs, усиливали пролиферацию опухолевых клеток. Будущие исследования будут включать другие типы клеток для изучения клеточных взаимодействий в контексте рецидива рака после терапии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод гидрогеля во многом зависит от количества стартовой ткани. M’urine MFPs малы, и процесс децеллюляризации приводит к значительному сокращению материала(Таблица 1). Процесс может быть повторен с более MFPs увеличить конечную доходность. Мельница является еще одним важным шаг…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят д-р Лаура Л. Бронсарт для предоставления GFP- и luciferase-4T1 клетки, д-р Эдвард Л. Лагори за советом по 1 -(No 4-(Xylylazo)xylyl’azo)-2-нафталь окрашивания, д-р Крейг Л. Дюваль для IVIS и лиофилизатор использования, и д-р Скотт Гюль Использовать. Это исследование было финансово поддержано грантом NIH #R00CA201304.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | – |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | – |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | – |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | – |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | – |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | – |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | – |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | – |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | – |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | – |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | – |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | – |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | – |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | – |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | – |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | – |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | – |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | – |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
- Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
- Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
- Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
- Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
- Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
- Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
- Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
- Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).
