Изучение метаболизма шести системных инсектицидов в недавно созданной культуре подвески клеток, полученных из чая(Камелия Sinensis L.) Листья
Summary
Эта работа представляет собой протокол для создания культуры клеточной подвески, полученной из чая(Camellia sinensis L.) листья, которые могут быть использованы для изучения метаболизма внешних соединений, которые могут быть рассмотрены всего растения, такие как инсектициды.
Abstract
Разработана платформа для изучения метаболизма инсектицидов с использованием тканей в пробирке чайного растения. Листья из стерильных чайных растений были индуцированы, чтобы сформировать свободные каллусы на Мурашиге и Skoog (MS) базальных носителей с растительными гормонами 2,4-dichlorophenoxyacetic кислоты (2,4-D, 1,0 мг L-1) и kinetin (KT, 0,1 мг L-1). Каллус формируется после 3 или 4 раундов субкультирования, каждый из которых длится 28 дней. Свободный каллуса (около 3 г) затем прививался в В5 жидких носителей, содержащих те же растительные гормоны и культивировался в дрожащий инкубатор (120 об/мин) в темноте при 25 и 1 градус цельсия. После субкультуры, 3х4, клеточная суспензия, полученная из листьев чая, была установлена в соотношении субкультуры в диапазоне от 1:1 до 1:2 (жидкость для матери подвески: свежая среда). Используя эту платформу, шесть инсектицидов (5 мкг мл мл-1 каждый тиаметоксам, имидаклоприд, ацетамиприд, имидаботиз, диметоат и ометоят) были добавлены в культуру клеточной суспензии, полученной из чайного листа. Метаболизм инсектицидов отслеживался с помощью жидкой хроматографии и газовой хроматографии. Для проверки полезности культуры суспензии чайных клеток метаболиты тиаметоксана и диметоата, присутствующие в обработанных клеточных культурах и нетронутых растениях, были сравнены с помощью масс-спектрометрии. В обработанных культурах чайных клеток было обнаружено семь метаболитов тиаметоксана и два метаболита диметоата, в то время как в обработанных нетронутых растениях были обнаружены только два метаболита тиаметоксама и один диметоат. Использование клеточной суспензии упростило метаболический анализ по сравнению с использованием нетронутых чайных растений, особенно для сложной матрицы, такой как чай.
Introduction
Чай является одним из наиболее широко потребляемых безалкогольных напитков в мире1,2. Чай производится из листьев и почек древесных многолетних Camellia sinensis L. Чай растения выращиваются на обширных плантациях и восприимчивы к многочисленным насекомым-вредителям3,4. Органофосфор и неоникотиноидные инсектициды часто используются в качестве системных инсектицидов5 для защиты чайных растений от вредителей, таких как белокрылки, листовые бункеры, и некоторые виды лепидоптеран6,7. После применения эти инсектициды поглощаются или перемещаются в растение. Внутри растения эти системные инсектициды могут трансформироваться путем гидролизов, окисления или снижения реакций растительных ферментов. Эти продукты преобразования могут быть более полярными и менее токсичными, чем родительские соединения. Однако, для некоторых органофосфатов, биоактивность некоторых продуктов выше. Например, ацефат метаболизируется в более токсичные метамидофос8,9,и диметоат в ометоате10,11. Таким образом, метаболические исследования растений имеют важное значение для определения судьбы пестицида в пределах завода12.
Культуры тканей растений оказались полезной платформой для исследования метаболизма пестицидов, с выявленными метаболитами, аналогичными тем, которые содержатся в нетронутых растениях13,14,15. Использование культур тканей, особенно культур суспензии клеток, имеет ряд преимуществ. Во-первых, эксперименты могут проводиться без микроорганизмов, избегая тем самым вмешательства в трансформацию пестицидов или деградацию микробов. Во-вторых, культура тканей обеспечивает последовательные материалы для использования в любое время. В-третьих, метаболиты легче извлекать из культур тканей, чем из нетронутых растений, и ткани культур часто имеют меньше интершеринговых соединений и более низкой сложности соединений. Наконец, культуры тканей могут быть более легко использованы для сравнения серии метаболизма пестицидов в одном эксперименте16.
В этом исследовании была успешно установлена клеточная суспензия, полученная из листьев выращенного стерильным чайного растения. Культура подвески чайных клеток была затем использована для сравнения поведения рассеяния шести системных инсектицидов.
Этот подробный протокол предназначен для обеспечения некоторых указаний, так что исследователи могут установить платформу культуры тканей растений полезно для изучения метаболических судьба ксенобиотики в чае.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье представлен подробный процесс создания модели метаболизма пестицидов в тканях чайного растения, включая выбор эксплантаторов, определение жизнеспособности клеток, а также создание культуры суспензии чайных клеток с высоким метаболизмом Деятельности. Любые части расти?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальной программой исследований и развития (2016YFD0200900) Китая, Национальным фондом естественных наук Китая (No 31772076 и No 31270728), Китайским фондом постдокторской науки (2018M630700) и Открытым фондом Государственная ключевая лаборатория биологии и утилизации чайных растений (SKLTOF20180111).
Materials
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
References
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
- Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
- Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
- Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
- Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
- Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
- Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
- Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. Fatal intoxication with omethoate. International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).
- Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
- Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
- Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
- Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
- Sandermann, H., Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
- Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
- Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
- Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
- Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
- Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
- Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
- Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O’Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
- Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
- Yang, G. W. . Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , (2004).
- Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
- Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
- Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
- Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
- Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
- Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
- Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).
