차에서 파생된 새로 설립된 세포 현탁액 배양에서 6개의 전신 살충제의 물질대사에 관한 연구(동백나무시넨시스 L.) 잎
Summary
이 연구는 살충제 와 같은 전체 식물에 의해 채택될 수 있는 외부 화합물의 대사를 연구하는데 사용될 수 있는 차(동백나무)에서 유래된 세포 현탁액 배양을 확립하기 위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
차 공장의 체외 조직을 사용하여 살충제 대사를 연구하기위한 플랫폼이 개발되었습니다. 멸균차 식물로부터의 잎은 식물 호르몬 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D, 1.0 mg L-1)과 키네틴(KT, 0.1mg L-1)을 가진 무라시게및 스쿠그(MS) 기저 매에 느슨한 굳은살을 형성하도록 유도하였다. 캘러스는 각각 28 일 동안 지속되는 3 또는 4 라운드의 후 형성되었습니다. 느슨한 캘러스(약 3 g)를 동일한 식물 호르몬을 함유하는 B5 액상 배지로 접종한 후 25±1°C에서 어둠 속에서 흔들리는 인큐베이터(120 rpm)에서 배양하였다. 3-4 서브컬쳐 후, 차잎에서 유래된 세포 현탁액을 1:1 및 1:2(현탁액 어머니 액체: 신선한 배지) 사이의 하위 배양 비율로 확립하였다. 이 플랫폼을 사용하여, 6개의 살충제(5 μg mL-1 각 티아메톡삼, 이미다클로프리드, 아세트타미프리드, 이미다클로시즈, 디메토에이트 및 오메토아테)를 차 잎 유래 세포 현탁액 배양에 첨가하였다. 살충제의 대사를 액체 크로마토그래피 및 가스 크로마토그래피를 사용하여 추적했습니다. 차 세포 현탁액 배양의 유용성을 검증하기 위해, 처리된 세포 배양 및 손상되지 않은 식물에 존재하는 티아메톡산 및 디메토이트의 대사산물을 질량분광법을 사용하여 비교하였다. 처리된 차 세포 배양에서, 티아메톡산의 7개의 대사산물 및 디메토아테의 2개의 대사산물이 발견되었으며, 처리된 그대로 식물에서는 티아메톡삼의 대사산물 2개와 디메토에이트 중 하나만 발견되었다. 세포 현탁액의 사용은 특히 차와 같은 어려운 매트릭스에 대해 그대로 차 식물의 사용에 비해 대사 분석을 단순화했다.
Introduction
차는 세계에서 가장 널리 소비되는 무알코올 음료중 하나입니다 1,2. 차는 우디다년 동백꽃의 잎과 싹에서 생산되며 L. 차 식물은 광대한 농장에서 재배되며 수많은 곤충 해충3,4에취약하다. 유기인산및네오니코티노이드 살충제는 백색파리, 잎호퍼 및 일부 레피도프테란 종6,7과 같은 해충으로부터 차 식물을 보호하기 위해 전신 살충제5로 자주 사용된다. 적용 후, 이러한 살충제는 흡수되거나 식물로 전이됩니다. 식물 내에서, 이러한 전신 살충제는 식물 효소에 의해 가수 분해, 산화 또는 환원 반응을 통해 형질전환될 수 있다. 이러한 변형 제품은 모 화합물보다 더 극성 및 덜 독성이 있을 수 있습니다. 그러나 일부 유기 인산염의 경우 일부 제품의 생체 활동이 더 높습니다. 예를 들어, 아세트산은 보다 독성이 강한 메타미도포스8, 9, 및 이메토에이트 내로 대사되어10,11. 식물 대사 연구는 따라서 식물 내의 농약의 운명을 결정하는 데 중요하다12.
식물 조직 배양은 농약 대사를 조사하기 위한 유용한 플랫폼으로 입증되었으며, 확인된 대사산물은 그대로식물13,14,15에서발견되는 것과 유사하다. 조직 배양, 특히 세포 현탁액 배양의 사용은 몇 가지 장점을 갖는다. 첫째, 실험은 미생물이 없는 실험을 수행하여 미생물에 의한 농약 변형 또는 분해의 간섭을 피할 수 있습니다. 둘째, 조직 배양은 언제든지 사용하기 위한 일관된 물질을 제공한다. 셋째, 대사 산물은 손상되지 않은 식물보다 조직 배양에서 추출하기가 더 쉬울 수 있으며, 조직 배양은 종종 인터링 화합물이 적고 화합물의 복잡성이 낮습니다. 마지막으로, 조직 배양은 단일 실험16에서일련의 농약 대사를 비교하는데 보다 용이하게 사용될 수 있다.
본 연구에서는 멸균 재배 차 식물의 잎에서 파생 된 세포 현탁액이 성공적으로 확립되었습니다. 차 세포 현탁액 배양은 6개의 전신 살충제의 발산 거동을 비교하기 위해 사용되었다.
이 상세한 프로토콜은 연구원이 차에 있는 xenobiotics의 신진 대사 운명을 공부하기 위하여 유용한 식물 조직 문화 플랫폼을 설치할 수 있도록 몇몇 지도를 제공하기 위한 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사는 이식물의 선택, 세포 생존력의 결정, 높은 대사를 가진 차 세포 현탁액 배양의 확립을 포함하여 차 식물 조직에 있는 농약 물질 대사의 모형을 설치하는 상세한 과정을 제시합니다 활동. 식물 조직의 모든 부분은 살균 된 환경에서 굳은 살을 시작하는 데 사용할 수있습니다 25. 차 잎은 이 연구에서 캘러스 개시를 위해 선택되었으며, 잎이 지하 부분보다 덜 오염되는 경?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국의 국가 핵심 연구 및 개발 프로그램 (2016YFD0200900), 중국의 국가 자연 과학 재단 (No. 31772076 및 No. 31270728), 중국 박사 후 과학 재단 (2018M630700), 그리고 오픈 펀드의 지원을 받았습니다. 차 식물 생물학 및 활용의 국가 키 연구소 (SKLTOF20180111).
Materials
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
References
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
- Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
- Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
- Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
- Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
- Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
- Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
- Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. Fatal intoxication with omethoate. International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).
- Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
- Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
- Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
- Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
- Sandermann, H., Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
- Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
- Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
- Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
- Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
- Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
- Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
- Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O’Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
- Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
- Yang, G. W. . Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , (2004).
- Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
- Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
- Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
- Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
- Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
- Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
- Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).
