Bu çalışma, bir hücre süspansiyon kültürü çay (Camellia sinensis L.) bu böcek ilaçları gibi tüm bitki tarafından alınabilir dış bileşiklerin metabolizmasını incelemek için kullanılabilir yaprakları türetilen kurulması için bir protokol sunuyor.
Çay bitkinin in vitro dokularında kullanarak böcek ilacı metabolizmasını incelemek için bir platform geliştirilmiştir. Steril çay fidanları yaprakları Murashige ve Skoog üzerinde gevşek nasır oluşturmak için indüklenen edildi (MS) bitki hormonları ile bazal medya 2, 4-dichlorophenoxyasetic asit (2, 4-D, 1,0 mg l-1) ve Kinetin (kt, 0,1 mg l-1). Callus, her biri 28 gün süren 3 veya 4 turdan sonra kuruldu. Loose nasır (yaklaşık 3 g) daha sonra aynı bitki hormonları içeren B5 sıvı medya içine aşı ve 25 ± 1 °c karanlıkta bir sallayarak kuluçk (120 rpm) kültürlü oldu. 3 − 4 alt kültürden sonra, 1:1 ve 1:2 (süspansiyon anne sıvısı: taze orta) arasında değişen bir alt kültür oranıyla çay yapraklarından türetilen bir hücre süspansiyonu kuruldu. Bu platformu kullanarak, altı böcek öldürücüler (5 μg mL-1 her thiaetoxam, imidacloprid, acetayiprid, imidaclothiz, dimethoate, ve omethoate) çay yaprağı türeyen hücre süspansiyon kültürü içine eklenmiştir. Böcek öldürücülerinin metabolizması sıvı kromatografi ve gaz kromatografi kullanılarak izleniyordu. Çay hücresi süspansiyonu kültürünün kullanışlılığını doğrulamak için, tedavi edilen hücre kültürlerinde ve bozulmamış bitkilerin içinde bulunan thiaminetoxan ve dimethoate metabolitleri kitle spektrometresi kullanılarak karşılaştırıldı. Tedavi edilen çay hücresi kültürlerinde, thiametoksin yedi metabolitleri ve dimethoate iki metabolitleri bulundu, tedavi edilen bozulmamış bitkiler iken, thiametokam sadece iki metabolitleri ve bir dimethoate bulundu. Bir hücre süspansiyonunun kullanımı, özellikle çay gibi zor bir matris için, bozulmamış çay bitkilerin kullanımına kıyasla metabolik analizini basitleştirmiştir.
Çay dünya1,2en çok tüketilen alkolsüz içeceklerin biridir. Çay yaprakları ve odunsu çok yıllık Camellia sinensis L. çay bitkileri büyük tarlaları yetiştirilen ve çok sayıda böcek zararlıları için duyarlı olan tomurcukları üretilmektedir3,4. Organophosphorus ve egemenliğinize böcek ilaçları genellikle sistemik böcek öldürücüler olarak kullanılır5 whiteflies gibi zararlıları çay bitkileri korumak için, yaprak Hoppers, ve bazı lepidopteran türler5/6. Uygulamadan sonra, bu böcek öldürücüler bitki içine emilir veya transloke. Tesis içinde, bu sistemik böcek öldürücüler hidroliz, oksidasyon veya bitki enzimlerinin azaltma reaksiyonları yoluyla dönüştürülebilir. Bu dönüşüm ürünleri daha Polar ve üst bileşiklerin daha az toksik olabilir. Ancak, bazı organofosfat için, bazı ürünlerin bioactivities daha yüksektir. Örneğin, acephate daha toksik methasidophos içinde metabolize edilir8,9, ve omethoate içine dimethoate10,11. Bitki metabolik çalışmalar bu nedenle bir bitki içinde bir pestisit kaderini belirlemek için önemlidir12.
Bitki dokusu kültürler pestisit metabolizmasını araştırmak için yararlı bir platform olduğu kanıtlanmıştır, tespit metabolitleri bozulmamış bitkiler bulunan benzer ile13,14,15. Doku kültürlerinin kullanımı, özellikle hücre süspansiyon kültürler, çeşitli avantajları vardır. Öncelikle, deneyler mikroorganizmaların serbest yapılabilir, böylece pestisit dönüşümü veya mikroplar tarafından bozulması müdahalesi kaçınarak. İkincisi, doku kültürü her zaman kullanım için tutarlı malzemeler sağlar. Üçüncüsü, metabolitleri bozulmamış bitkilerin daha doku kültürlerinden ayıklamak için daha kolay, ve doku kültürler genellikle daha az interring bileşikleri ve bileşiklerin daha düşük karmaşıklık var. Son olarak, doku kültürler daha kolay tek bir deneme16pestisit metabolizması bir dizi karşılaştırmak için kullanılabilir.
Bu çalışmada, steril-yetiştirilen çay bağlanırlar yapraklarından türetilen bir hücre süspansiyonu başarıyla kuruldu. Daha sonra çay hücresi süspansiyon kültürü, altı sistemik böcek öldürücülerine ilişkin dağılma davranışlarını karşılaştırmak için kullanılmıştır.
Bu ayrıntılı protokol, araştırmacılar bir bitki dokusu kültür platformu çay Ksenobiyotiklerin metabolik kaderi incelemek için yararlı kurabilir, böylece bazı rehberlik sağlamak için tasarlanmıştır.
Bu makalede, explants seçimi, hücre viability belirlenmesi ve yüksek metabolik ile bir çay hücresi süspansiyon kültürünün kurulması da dahil olmak üzere, çay bitki dokusu pestisit metabolizması bir model kurulması ayrıntılı süreci sunar Etkinlik. Bir bitki dokusunun herhangi bir parçası sterilize edilmiş bir ortamda nasır başlatmak için kullanılabilir25. Çay yaprakları bu çalışmada nasır başlatma için seçildi, sadece çünkü yaprakları daha az zemin altında pa…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma ulusal anahtar araştırma & geliştirme programı (2016YFD0200900) Çin, Çin Ulusal Doğal bilimsel Vakfı (No. 31772076 ve No. 31270728), Çin doktora sonrası Bilim Vakfı (2018M630700) ve açık Fonu tarafından destekleniyordu Çay tesisi biyoloji ve kullanım devlet anahtar Laboratuvarı (SKLTOF20180111).
Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |