Studie over het metabolisme van zes systemische insecticiden in een nieuw opgerichte cel schorsing cultuur afgeleid van thee (Camellia sinensis L.) Bladeren
Summary
Dit werk presenteert een protocol voor de oprichting van een cel schorsing cultuur afgeleid van thee (Camellia sinensis L.) bladeren die kunnen worden gebruikt om het metabolisme van de externe verbindingen die kunnen worden opgenomen door de hele plant, zoals insecticiden studie.
Abstract
Een platform voor het bestuderen van insecticide metabolisme met behulp van in vitro weefsels van theeplant werd ontwikkeld. De bladeren van steriele thee plantjes werden veroorzaakt om losse aanroepus op Murashige en Skoog (Mej.) basismedia met de installatie hormonen te vormen 2, 4-dichlorophenoxyacetic zuur (2, 4-D, 1,0 mg L-1) en KINETIN (KT, 0,1 mg l-1). Aanroepus vormde zich na 3 of 4 rondes van subculturing, elk die 28 dagen duurt. Losse Callus (ongeveer 3 g) werd vervolgens geënt in B5 vloeibare media met dezelfde plantenhormonen en werd gekweekt in een schudden incubator (120 rpm) in het donker bij 25 ± 1 ° c. Na 3 − 4 subculturen, een cel schorsing afgeleid van thee blad werd vastgesteld op een subcultuur ratio variërend tussen 1:1 en 1:2 (schorsing moeder vloeistof: vers medium). Met behulp van dit platform, zes insecticiden (5 µ g mL-1 elk thiamethoxam, Imidacloprid, Acetamiprid, imidaclothiz, dimethoaat, en omethoaat,) werden toegevoegd in de thee Leaf-afgeleide cel schorsing cultuur. Het metabolisme van de insecticiden werd gevolgd gebruikend vloeibare chromatografie en de chromatografie van het gas. Om het nut van de Tea Cell Suspension cultuur te valideren, werden de metabolieten van thiamethoxan en dimethoaat aanwezig in behandelde cellen culturen en intacte planten vergeleken met massaspectrometrie. In behandelde Tea Cell culturen, zeven metabolieten van thiamethoxan en twee metabolieten van dimethoaat werden gevonden, terwijl in behandelde intacte planten, slechts twee metabolieten van thiamethoxam en een van dimethoaat werden gevonden. Het gebruik van een cel schorsing vereenvoudigde de metabole analyse in vergelijking met het gebruik van intacte thee planten, vooral voor een moeilijke matrix zoals thee.
Introduction
Thee is een van de meest geconsumeerde non-alcoholische dranken in de wereld1,2. Thee wordt geproduceerd uit de bladeren en knoppen van de Woody meerjarige Camellia sinensis L. thee planten worden geteeld in grote plantages en zijn vatbaar voor tal van insectenplagen3,4. Organophosphorus en neonicotinoid insecticiden worden vaak gebruikt als systemische insecticiden5 om thee planten te beschermen tegen plagen zoals whiteflies, Leaf hoppers, en sommige Lepidoptera soorten6,7. Na toepassing, worden deze insecticiden geabsorbeerd of in de installatie verplaatst. Binnen de plant kunnen deze systemische insecticiden worden getransformeerd door middel van hydrolyse, oxidatie of reductiereacties door plantaardige enzymen. Deze transformatie producten kunnen meer polaire en minder giftig dan de bovenliggende verbindingen. Echter, voor sommige organofosfaten, de bioactiviteiten van sommige producten zijn hoger. Bijvoorbeeld, wordt acefaat omgezet in giftigere methamidofos8,9, en dimethoaat in omethoaat,10,11. De metabolische studies van de installatie zijn zo belangrijk voor het bepalen van het lot van een pesticide binnen een installatie12.
Plant aardige weefselculturen zijn bewezen een nuttig platform voor het onderzoek van het metabolisme van pesticiden, met de geïdentificeerde metabolieten vergelijkbaar met die gevonden in intact planten13,14,15. Het gebruik van weefselculturen, in het bijzonder de cellen schorsing culturen, heeft een aantal voordelen. Ten eerste, experimenten kunnen worden uitgevoerd vrij van micro-organismen, waardoor de interferentie van pesticide transformatie of degradatie door microben te voorkomen. Ten tweede, weefselcultuur biedt consistente materialen voor gebruik op elk gewenst moment. Ten derde, de metabolieten zijn gemakkelijker te halen uit weefselculturen dan van intacte planten, en weefselculturen hebben vaak minder interring verbindingen en lagere complexiteit van verbindingen. Ten slotte kan weefselculturen gemakkelijker worden gebruikt om een reeks van pesticiden metabolisme te vergelijken in een experiment16.
In deze studie, een cel schorsing afgeleid van de bladeren van steriel geteelde thee plantlet werd met succes vastgesteld. De Tea Cell Suspension cultuur werd vervolgens gebruikt om de dissipatie gedrag van zes systemische insecticiden te vergelijken.
Dit gedetailleerde protocol is bedoeld om enige leidraad te bieden, zodat onderzoekers kunnen een plantweefsel cultuur platform nuttig voor het bestuderen van de metabole lot van xenobiotica in thee vast te stellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel presenteert het gedetailleerde proces van de vaststelling van een model van het metabolisme van pesticiden in theeplant weefsel, met inbegrip van de selectie van Explants, de bepaling van de levensvatbaarheid van de cellen, en de oprichting van een thee-cel schorsing cultuur met een hoge metabole Activiteit. Om het even welke delen van een installatie weefsel zouden kunnen worden gebruikt om aanroepus in een gesteriliseerde milieu te initialiseren25. Thee bladeren werden gekozen voor C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het nationale belangrijkste onderzoek & ontwikkelingsprogramma (2016YFD0200900) van China, de nationale natuurlijke wetenschappelijke stichting van China (nr. 31772076 en nr. 31270728), de postdoctorale Stichting van de wetenschap van China (2018M630700), en open fonds van Staat zeer belangrijk laboratorium van de biologie en het gebruik van de thee installatie (SKLTOF20180111).
Materials
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
References
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
- Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
- Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
- Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
- Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
- Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
- Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
- Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. Fatal intoxication with omethoate. International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).
- Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
- Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
- Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
- Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
- Sandermann, H., Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
- Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
- Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
- Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
- Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
- Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
- Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
- Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O’Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
- Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
- Yang, G. W. . Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , (2004).
- Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
- Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
- Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
- Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
- Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
- Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
- Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).
