Studier på metabolismen av seks systemiske insektmidler i en nylig etablert Cell suspensjon kultur avledet fra Tea (Camellia Sinensis L.) Blader
Summary
Dette arbeidet presenterer en protokoll for å etablere en celle suspensjon kultur avledet fra te (Camellia Sinensis L.) blader som kan brukes til å studere metabolismen av eksterne forbindelser som kan tas opp av hele planten, slik som insektmidler.
Abstract
En plattform for å studere insektmiddel metabolisme bruker in vitro vev av te anlegget ble utviklet. Leaves fra steril te plantlets ble indusert å danne løse Callus på Murashige og Skoog (MS) basal Media med anlegget hormoner 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D, 1,0 mg L-1) og KINETIN (KT, 0,1 mg l-1). Callus dannet etter 3 eller 4 runder med subculturing, hver varig 28 dager. Loose Callus (ca 3 g) ble deretter inokulert i B5 flytende medier som inneholder samme plantehormoner og ble kultivert i en risting inkubator (120 RPM) i mørket ved 25 ± 1 ° c. Etter 3 − 4 subkulturer, en celle suspensjon avledet fra Tea Leaf ble etablert på et under kultur forhold som spenner mellom 1:1 og 1:2 (suspensjon mor væske: fersk medium). Ved hjelp av denne plattformen, seks insektmidler (5 μg mL-1 hver thiamethoxam, imidacloprid, acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate, og omethoate) ble lagt inn i te blad-avledet celle suspensjon kultur. Metabolismen av insektmidler ble sporet ved hjelp av flytende kromatografi og gass kromatografi. Å validere nytten av te celle suspensjon kultur, metabolitter av thiamethoxan og dimethoate tilstede i behandlet cellekulturer og intakt planter ble sammenlignet ved hjelp av masse massespektrometri. I behandlede te cellekulturer, syv metabolitter av thiamethoxan og to metabolitter av dimethoate ble funnet, mens i behandlet intakt planter, bare to metabolitter av thiamethoxam og en av dimethoate ble funnet. Bruken av en celle suspensjon forenklet metabolsk analyse i forhold til bruk av intakt te planter, spesielt for en vanskelig matrise som te.
Introduction
Te er en av de mest brukte alkoholfrie drikkevarer i verden1,2. Te er produsert fra bladene og knopper av woody flerårig Camellia Sinensis L. te planter dyrkes i store plantasjer og er mottakelige for mange insekt skade3,4. Organofosfor og neonicotinoid insektmidler blir ofte brukt som systemiske insektmidler5 for å beskytte te planter fra planter som whiteflies, Leaf Hoppers, og noen Lepidoptera arter6,7. Etter påføring blir disse insektmidler absorbert eller translocated inn i anlegget. Innenfor anlegget, kan disse systemiske insektmidler bli forvandlet gjennom hydrolyse, oksidasjon eller reduksjon reaksjoner av plante enzymer. Disse transformasjon produkter kan være mer Polar og mindre giftig enn den overordnede forbindelser. Imidlertid, for noe organophosphates, det bioactivities av noe produktene er høyere. For eksempel er acephate metaboliseres til mer giftig methamidophos8,9, og dimethoate i omethoate10,11. Plant metabolske studier er derfor viktig for å bestemme skjebnen til en plantevernmidler innenfor en plante12.
Plante vev kulturer har vist seg å være en nyttig plattform for å undersøke plantevernmidler metabolisme, med identifiserte metabolitter ligner de som finnes i intakt planter13,14,15. Bruken av vev kulturer, spesielt celle suspensjon kulturer, har flere fordeler. For det første kan eksperimenter utføres uten mikroorganismer, og dermed unngår forstyrrelser av plantevernmidler transformasjon eller degradering av mikrober. For det andre gir vev kultur konsistent materiale til bruk når som helst. For det tredje er metabolitter lettere å trekke ut fra vev kulturer enn fra intakt planter, og vev kulturer ofte har færre interring forbindelser og lavere kompleksitet av forbindelser. Endelig kan vev kulturer lettere brukes til å sammenligne en rekke plantevernmidler metabolisme i et enkelt eksperiment16.
I denne studien ble en celle suspensjon avledet fra bladene av sterile dyrket te plantlet vellykket etablert. Den te celle suspensjon kulturen ble deretter brukt til å sammenligne spredning atferd av seks systemiske insektmidler.
Denne detaljerte protokollen er ment å gi noen veiledning slik at forskerne kan etablere en plante vev kultur plattform nyttig for å studere metabolsk skjebne xenobiotics i te.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkelen presenterer den detaljerte prosessen med å etablere en modell av plantevernmidler metabolisme i te plante vev, inkludert valg av explants, fastsettelse av celle levedyktighet, og etablering av en te-celle suspensjon kultur med høy metabolske Aktivitet. Alle deler av et plante vev kan brukes til å initiere Callus i et sterilisert miljø25. Tea bladene ble valgt for Callus innvielse i denne studien, ikke bare fordi bladene til en tendens til å være mindre forurenset enn delene …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av den nasjonale nøkkel forskning & Development program (2016YFD0200900) i Kina, National Natural Scientific Foundation i Kina (nr. 31772076 og nr. 31270728), Kina postdoktor Science Foundation (2018M630700), og Open Fund of State Key laboratorium te Plant biologi og utnyttelse (SKLTOF20180111).
Materials
| Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
| Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
| Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
| Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
| Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
| Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
| Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
| Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
| Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
| Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
| 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
| chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
| Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
| HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
| Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |
References
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al. Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).
- Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).
- Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).
- Hou, R. Y., et al. Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles. Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).
- Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).
- Fang, Q., et al. Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes. Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).
- Pan, R., et al. Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis). PloS One. 10 (9), e0138309 (2015).
- Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. Fatal intoxication with omethoate. International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).
- Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.). Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).
- Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal. International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).
- Ford, K. A., Casida, J. E. Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).
- Frear, D. S., Swanson, H. R. Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton. Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).
- Sandermann, H., Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).
- Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).
- Lichtner, F. Phloem mobility of crop protection products. Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).
- Sun, J., et al. Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea. Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).
- Meng, M. T., et al. Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L). Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).
- Hou, R. Y., et al. Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).
- Karmakar, R., Kulshrestha, G. Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop. Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).
- Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O’Brien, R. D. Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).
- Lucier, G. W., Menzer, R. E. Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).
- Yang, G. W. . Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties. , (2004).
- Jiao, W., et al. Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).
- Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).
- Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium. Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).
- Grover, A., et al. Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).
- Lei, P. D., et al. Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis. Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).
- Hou, X., Guo, W. The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell. Guihaia. 18, 169-172 (1998).
- Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques. ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).
