Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Identificeren van aminozuur Overproducers met behulp van zeldzame-codon-Rich markers

Published: June 24, 2019 doi: 10.3791/59331
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Molecular Medicine and Biotherapy, School of Life Sciences, Beijing Institute of Technology, 2UCLA Institute for Technology Advancement (Suzhou)

Summary

Deze studie presenteert een alternatieve strategie voor de conventionele toxische analoge gebaseerde methode bij het identificeren van aminozuur overproducers door gebruik te maken van zeldzame-codon-rijke markers om tegelijkertijd nauwkeurigheid, gevoeligheid en hoge doorvoer te bereiken.

Abstract

Om te voldoen aan de steeds groeiende markt voor aminozuren, zijn high-performance productie stammen nodig. Het aminozuur overproducers worden conventioneel geïdentificeerd door het benutten van de competities tussen aminozuren en hun analogen. Echter, deze analoge gebaseerde methode is van lage nauwkeurigheid, en goede analogen voor specifieke aminozuren zijn beperkt. Hier presenteren we een alternatieve strategie die een accurate, gevoelige en high-throughput screening van aminozuur overproducers met behulp van zeldzame-codon-rijke markers mogelijk maakt. Deze strategie is geïnspireerd door het fenomeen van codon gebruik bias in eiwit vertaling, waarvoor Codons zijn onderverdeeld in gemeenschappelijke of zeldzame degenen op basis van hun frequentie van voorkomen in het coderen van DNA. De vertaling van zeldzame Codons hangt af van hun corresponderende zeldzame overdrachts rna's (trna's), die niet volledig kunnen worden opgeladen door de verwant aminozuren onder de honger. Theoretisch kan de zeldzame tRNAs worden opgeladen als er een overschot van de aminozuren is na het opladen van de synoniem gemeenschappelijke isoacceptors. Daarom kunnen vertraagde vertalingen veroorzaakt door zeldzame Codons worden hersteld door het voeden of intracellulaire overproducties van de overeenkomstige aminozuren. Onder deze aanname wordt een selectie-of screeningsysteem voor het identificeren van aminozuur overproducenten vastgesteld door de gemeenschappelijke Codons van de beoogde aminozuren te vervangen door hun synoniem zeldzame alternatieven in de antibioticaresistentie-genen of de genen coderen van fluorescerende of chromogene eiwitten. We tonen aan dat de eiwit uitdrukkingen sterk kunnen worden gehinderd door de opname van zeldzame Codons en dat de niveaus van eiwitten positief correleren met de aminozuur concentraties. Met behulp van dit systeem, overproducers van meerdere aminozuren kunnen gemakkelijk worden afgeschermd uit mutatie bibliotheken. Deze zeldzame-codon-gebaseerde strategie vereist slechts één gemodificeerd gen, en de gastheer is minder geneigd om te ontsnappen aan de selectie dan in andere methoden. Het biedt een alternatieve aanpak voor het verkrijgen van aminozuur overproducers.

Introduction

De huidige productie van aminozuren is sterk afhankelijk van fermentatie. Echter, de Antilichaamtiters en opbrengsten voor de meeste aminozuren productie stammen zijn onder de stijgende eisen van de wereldwijde aminozuur markt die miljarden dollars waard is1,2. Het verkrijgen van high-performance aminozuur overproducers zijn essentieel voor de upgrade van de aminozuur industrie.

Traditionele strategie voor het identificeren van aminozuur overproducers exploiteert de competities tussen aminozuren en hun analogen in eiwitsynthese3,4. Deze analogen zijn in staat om de Trna's die de overeenkomstige aminozuren herkennen en dus remmen de rek van de peptide ketens, leidt tot gearresteerd groei of celdood5. Een manier om weerstand te bieden aan de analoge spanningen is het verhogen van de concentraties van intracellulaire aminozuren. De verrijkte aminozuren zullen de analogen voor de eindige Trna's overtreffen en zorgen voor de juiste synthese van functionele eiwitten. Daarom kunnen stammen die de analogen overleven, worden geselecteerd en zijn ze waarschijnlijk de overproducenten van de overeenkomstige aminozuren.

Hoewel bewezen succesvol in het selecteren van overproducers voor aminozuren zoals L-leucine6, de analoge-gebaseerde strategie lijdt aan ernstige nadelen. Een belangrijk punt van zorg is de analoge weerstand die voortkomt uit het proces van mutagenese of door spontane mutaties. Stammen met resistentie kunnen ontsnappen aan de selectie door het blokkeren, exporteren of vernederende de analogen5. Een andere zorg is de toxische neveneffecten van de analogen op andere cellulaire processen7. Als gevolg daarvan, stammen die de analoge selectie overleven mogelijk niet het aminozuur overproducers, terwijl de gewenste overproducers kunnen worden ten onrechte uitgeroeid als gevolg van de negatieve bijwerkingen.

Hier wordt een nieuwe strategie op basis van de wet van codon bias gepresenteerd om nauwkeurige en snelle identificaties van aminozuur overproducers te bereiken. De meeste aminozuren worden gecodeerd door meer dan één nucleotide triplet die anders wordt begunstigd door de gastheerorganismen8,9. Sommige Codons worden zelden gebruikt in de codeer sequenties en worden de zeldzame Codons genoemd. Hun vertalingen in aminozuren vertrouwen op de verwant trna's die de corresponderende aminozuren dragen. Echter, de Trna's die zeldzame Codons herkennen hebben meestal veel lagere Abundances dan de Trna's van de gemeenschappelijke Codons10,11. Bijgevolg zijn deze zeldzame Trna's minder waarschijnlijk de vrije aminozuren vast te leggen in de competities met andere isoacceptoren, en vertalingen van de zeldzame-codon-rijke sequenties beginnen te vertragen of zelfs worden beëindigd wanneer de hoeveelheden aminozuren beperkt zijn 10. de vertalingen kunnen in theorie worden hersteld als er na het opladen van een aminozuur overschot de synoniem gebruikelijke Trna's worden opgeladen als gevolg van overproducties of extra voedingen van de overeenkomstige aminozuren12. Als het zeldzame-codon-rijke gen een selectie-of screening marker codeert, kunnen stammen die de corresponderende fenotypes vertonen, gemakkelijk worden geïdentificeerd en zijn ze waarschijnlijk de overproducenten van de beoogde aminozuren.

De bovengenoemde strategie is van toepassing op de vaststelling van een selectie en een screeningsysteem voor de identificatie van aminozuur overproducenten. Het selectiesysteem gebruikt antibioticaresistentiegenen (bijv. kanR) als markers, terwijl het screenings systeem gebruik maakt van de genen codering fluorescentie (bijv. groen FLUORESCERENDE eiwitten [GFP]) of Chromogene (bijv. prancerpurple) eiwitten. De marker genen in beide systemen worden gewijzigd door het vervangen van gedefinieerde aantallen van de gemeenschappelijke Codons voor het beoogde aminozuur met zijn synoniem zeldzame alternatief. Stammen in de mutatie bibliotheek die het zeldzame-codon-rijke marker gen in de haven worden geselecteerd of gescreend onder de juiste omstandigheden, en de overproducenten van de beoogde aminozuren kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. De werkstroom begint met de bouw van het zeldzame-codon-rijke marker gensysteem, gevolgd door de optimalisatie van de arbeidsomstandigheden, en vervolgens de identificatie en verificatie van het aminozuur overproducers. Deze analoge-onafhankelijke strategie is gebaseerd op het dogma in eiwit vertaling en is praktisch geverifieerd om nauwkeurige en snelle identificaties van aminozuur overproducers mogelijk te maken. Theoretisch, het kan rechtstreeks worden gebruikt om aminozuren met zeldzame Codons en alle micro-organismen. In alle, de zeldzame-codon gebaseerde strategie zal dienen als een efficiënt alternatief voor de conventionele analoge-gebaseerde aanpak wanneer de juiste analogen voor specifieke aminozuren niet beschikbaar zijn, of wanneer een hoge vals positief percentage is de grootste zorg. Het onderstaande protocol gebruikt Leucine rare codon om deze strategie te demonstreren bij de identificatie van Escherichia coli L-leucine overproducers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bouw van de plasmiden die de zeldzame codon-rijke marker genen uitdrukken

  1. Selecteer een marker gen dat een passend aantal van de gemeenschappelijke Codons voor het beoogde aminozuur bevat.
    Opmerking: voor L-leucine wordt de kanamycine resistentie Gene kanR, die 29 Leucine Codons bevat, waarvan 27 gemeenschappelijke Codons, gebruikt voor de bouw van het selectiesysteem13. Het GFP -gen, dat 17 gemeenschappelijke Codons van 19 Leucine Codons bevat, of het paarse eiwit codering-gen prancerpurple (PPG), dat 14 Leucine-gemeenschappelijke Codons herbergt, wordt gebruikt voor het screeningsysteem (aanvullende tabel 1 ).
  2. Vervang de gemeenschappelijke Codons in de marker genen door de synoniem zeldzame codon. Voor L-leucine, vervang de codons in kanr, GFP, of PPG met de zeldzame codon CTA, genereren kanR-RCS, GFP-RC, of PPG-RC, respectievelijk13 ( Aanvullende tabel 1).
    Opmerking: de frequentie van de zeldzame codon in de marker genen zal de striktheid van het selectie-of screeningsysteem beïnvloeden. In het algemeen zal het verhogen van het aantal zeldzame Codons de striktheid van het selectie-of screeningsysteem vergroten. Om de juiste selectie of screening sterkte te bereiken, ontwerpt u een reeks marker genen die verschillende aantallen zeldzame Codons in de haven en hun effecten vergelijken.
  3. Genereer bouwstenen van de zeldzame-codon-rijke marker genen met behulp van tools zoals GeneDesign14 (http://54.235.254.95/GD/) voor gensynthese. U ook de marker genen bestellen bij de commerciële gensynthese diensten.
    1. Kies op de pagina GeneDesign Building Block Design (overlap met constante lengte).
    2. Plak de sequenties van de zeldzame codon-rijke marker genen in de sequentie doos.
    3. Definieer de overlap lengte tussen de assemblage oligos; Houd er rekening mee dat de standaard 40 BP voor de meeste sequenties prima werkt.
      Opmerking: Zie de online handleiding voor meer instructies over de instellingen van de andere parameters.
    4. Klik op de knop bouwstenen ontwerpen en bestel de oligonucleotiden die op de pagina worden vermeld.
  4. Synthetiseren van de zeldzame-codon-gemodificeerde genen door polymerase chain reaction (PCR)-gebaseerde nauwkeurige synthese15.
  5. Ligate de zeldzame-codon-Rich kanR-RC naar vector pET-28a, GFP-RC naar pSB1C3, en ppg-RC naar CPB-37-44116.
    Opmerking: de pET-28a en pSB1C3 plasmide kaarten zijn beschikbaar op de SnapGene online plasmide database (aanvullende tabel 1); de CPB-37-441 plasmide kaart is beschikbaar op de ATUM chromogene proteïne website.
    1. Voeg op ijs de vector en de markerings fragmenten toe in een molaire verhouding van 1:1 tot 7,5 μL assemblage mengsel (Zie tabel met materialen) tot een totaal volume van 10 μL. Incuberen het monster bij 50 °C gedurende 1 uur.
    2. Transformeer 5 μL van het assemblage product in 50 μL van de bevoegde cellen (Zie de tabel met materialen) bij 42 °c gedurende 30 sec.
    3. Herstel de cellen in de Soc (Super optimale bouillon met van repressie) medium bij 37 °c gedurende 1 uur, plaat ze op lb (lysogeny Bouillon) agar-medium en incuberen ze bij 37 °c 's nachts.
    4. Inoculeren de kolonie in LB medium en incuberen bij 37 °C gedurende 8 uur.
    5. Isoleer het plasmide met een voorkeurs commerciële Kit.

2. optimaliseren van de selectie voorwaarden

  1. De voor mutagenese gebruikte moeder stam in de bevoegde cellen17maken.
  2. Transformeer 50 μL van de bevoegde cellen met 1 μL plasmide die het wild type kanrdraagt, en Transformeer een andere verzameling van de bevoegde cellen met de plasmide die kanr-RC29 met alle Leucine codon vervangen door de zeldzame codon CTA.
  3. Voeg 950 μL van het SOC-medium toe en inincuberen het monster in een shaker bij 250 rpm bij 37 °C gedurende 1 uur.
  4. Plaat 100 μL van de celkweek op het LB agar medium met 50 μg · mL-1 kanamycine, en incuberen het bij 37 °c gedurende ongeveer 8 uur totdat kolonies verschijnen.
  5. Kies de kolonies die de wild-type kanr en de Leucine rare-codon-Rich kanr-RC29 en gebruik elk om te inoculeren 5 ml vervijfvoudigd verdunde lb medium (0.2 x lb) bevattende 50 μg · ml-1 kanamycine. Inincuberen de monsters in een shaker bij 250 rpm bij 37 °C.
    Opmerking: het medium is cruciaal voor het selectiesysteem. Het moet net genoeg koolstof en stikstof bevatten om uitdrukking te geven aan de antibioticaresistentie-eiwitten uit het wild-type gen in plaats van van de zeldzame-codon-gemodificeerde derivaten. In dit geval is de L-leucine concentratie in 1x LB medium te hoog om de eiwit expressie van de zeldzame-codon-rijke kanRvolledig te remmen. Zo wordt een verdund LB-medium met een verdunningsfactor zoals 5 gebruikt om een duidelijk verschil in eiwit uitingen van het wild type en de zeldzame-codon-rijke genen te genereren.
  6. Breng 200 μL van elk van de celculturen over naar een 96-put in drievat op bepaalde tijdstippen (bijvoorbeeld 8 uur, 16 uur en 24 uur). Meet de OD600 (optische dichtheid bij 600 nm) met behulp van een plaat lezer.
    Opmerking: als een afname van de cel OD600 niet kan worden gedetecteerd voor stammen die de zeldzame-codon-rijke marker genen verharten in vergelijking met de OD600 van de stam die de wild-type marker genen verveelt, probeer dan de hoeveelheid zeldzame codon in de marker genen of gebruik een meer verdund medium.
  7. Voer de aminozuur test uit om te testen of de uitdrukkingen van de zeldzame codon rijke marker genen (bijv. kanR-RC29) kunnen worden hersteld door de concentratie van de beoogde aminozuren te verhogen.
    Let op: voor de selectie van L-leucine overproducers wordt L-leucine gebruikt voor het voeden.
    1. Inoculeren van de stammen die het kanR-RC29 marker gen harkotteren in 5 ml van 0,2 x lb (bevattende 50 μg · ml-1 kanamycine) met of zonder de toevoer van 1 g · L-1 l-leucine. Inoculeren nog eens 5 mL van de 0.2 x LB met stammen die de wild-type kanR als controle haven. Inincuberen de monsters in een shaker bij 250 rpm bij 37 °C.
    2. Meet de OD600 voor elke cultuur op bepaalde tijdstippen (bijvoorbeeld 15 uur, 17 uur, 19 uur en 22 uur).

3. optimaliseren van de screening omstandigheden

  1. Transformeer 50 μL van de voor mutagenese gebruikte moeder stam met 1 μL plasmide (~ 50 ng · μL-1) die het wild type GFP of het wild type PPGdraagt. Transformeer ook de ouderstam met de zeldzame-codon-rijke derivaten van de marker genen.
  2. Voeg 950 μL van het SOC-medium toe en inincuberen het monster in een shaker bij 250 rpm bij 37 °C gedurende 1 uur.
  3. Plaat 100 μL celkweek op het LB agar medium dat de juiste antibiotica bevat (25 μg · mL-1 chlooramfenicol voor het GFP plasmide dat een cmR -marker draagt, of 50 μg · ml-1 kanamycine voor de PPG plasmide die een kanR -marker draagt) en incuberen een nacht bij 37 °c.
  4. Kies een kolonie die het wild-type GFP of PPG en een kolonie die de bijbehorende zeldzame-codon-rijke afgeleide herbergt, en breng ze over naar 5 ml van de goed verdunde lb medium individueel. Inincuberen de monsters in een shaker bij 250 rpm bij 37 °C.
    Opmerking: voor E. coli stammen die de Leucine rare-codon-Rich GFP-RC of PPG-RContboren, kan het ONVERDUND lb medium (1x lb) worden gebruikt om significante verschillen in de uitdrukkingen van het wild-type en de zeldzame-codon-rijke marker te creëren Genen. Ook worden induceerbare cytochromen-promotors gebruikt om de uitdrukkingen van de screening-markers te stimuleren. Begin de inductie wanneer de cellen de exponentiële fase binnenkomen om betere discriminaties te bereiken.
  5. Breng voor fluorescentie markers 200 μL van elk van de celculturen over in een zwarte plaat met een 96-goed heldere bodem in drievat op gedefinieerde tijdstippen (bijvoorbeeld 2 uur, 4 uur en 6 uur). Meet de OD600 en de fluorescentie en bereken de intensiteit van de fluorescentie (de verhouding van fluorescentie tot od600). Meet voor chromogene markers de kleurontwikkeling van de celculturen.
    Opmerking: als lagere fluorescentie intensiteiten niet kunnen worden gedetecteerd voor stammen die de GFP-RC in vergelijking met die van de stammen die het wild-type GFPharkotteren, of als een lichtere kleur niet kan worden gedetecteerd voor cellen die het paarse eiwit uitdrukken van het PPG-RC dan van het wild-type gen, probeer het aantal zeldzame codon op de marker genen te verhogen of gebruik een meer verdund medium.
  6. Voer de toevoer test uit (Zie de stappen 2.7.1 en 2.7.2). Meet de intensiteit van de fluorescentie of de kleurontwikkeling op bepaalde tijdstippen (bijvoorbeeld 12 uur, 18 uur en 24 uur).

4. identificatie van het aminozuur-overproducers

  1. Beënt 100 μL van de cultuur van de mutanten in 5 mL LB medium (2% v/v) en inculeer het in een shaker bij 250 rpm bij 37 °C tot de waarden van OD600 0,4 bereiken.
  2. Maak de mutanten in competente cellen17.
  3. Transformeer 50 μL van de Mutante cellen met 1 μL van het plasmide (~ 50 ng · μL-1) met de selectie marker kanR-RC29 of de screening markeringen GFP-RC of PPG-RC. Voeg 950 μL SOC medium toe en draai het monster in een 37 °C Shaker gedurende 1 uur.
  4. Selecteer aminozuur overproducers.
    1. Centrifugeer de celkweek bij 4.000 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en voeg 5 ml 0,2 x lb medium met 50 μg · ml-1 kanamycine toe. Inbroed het monster 's nachts in een 37 °C Shaker.
    2. Plaat de nachtelijke cultuur (bijv. 100 μL, afhankelijk van de celdichtheid van de cultuur) op 0,2 x LB agar medium met 50 μg · mL-1 kanamycine en inincuberen bij 37 °c gedurende 12 uur.
      Let op: de kolonies ontwikkeld zijn de kandidaten van de beoogde aminozuur overproducers en, in dit geval, de L-leucine overproducers.
  5. Zeef het aminozuur overproducers.
    1. Plaat het juiste aantal cellen (bijv. 100 μL) die de screening marker (zoals beschreven in stap 4,3) verharsen op het LB agar medium dat het geschikte antibioticum bevat (25 μg · mL-1 chlooramfenicol voor screening met GFP-RC en 50 μg · ml -1 kanamycine voor screening met PPG-RC) en incuberen bij 37 °c gedurende 8 uur.
    2. Inoculeren van het LB-medium dat het geschikte antibioticum bevat (zie stap 4.5.1) met elke kolonie van de plaat. Inincuberen de monsters in een shaker bij 250 rpm bij 37 °C.
    3. Meet de OD600 en de fluorescentie en bereken de intensiteit van de fluorescentie als GFP-RC wordt gebruikt. Meet de kleurontwikkeling van de celculturen als PPG-RC wordt gebruikt. Merk op dat de stammen die een hogere intensiteit van de fluorescentie of een diepere kleur vertonen dan die van de ouderstam, de kandidaat-aminozuur overproducers zijn en in dit geval de overproducers van L-leucine.
      Opmerking: de fluorescentie-geactiveerde celsortering is ook geschikt voor het identificeren van eencellige High-producers wanneer de zeldzame-codon-rijke fluorescerende eiwit genen worden gebruikt voor screening.
  6. Controleer de aminozuur productiviteiten van de kandidaatstammen.
    1. Inoculeren 5 mL LB medium met elk van de kandidaatstammen en laat de cellen 's nachts groeien in een shaker bij 250 rpm bij 37 °C.
    2. Oogst de cellen van 1 mL celkweek door centrifugeren bij 4.000 x g gedurende 2 min. Gooi het supernatant weg en regeer de pellet met 1 ml steriel water.
    3. Inoculeren 20 mL M9 medium met 4% glucose met 200 μL van de celsuspensie en incuberen in een 250 mL Shaker bij 250 rpm bij 37 °C gedurende 24 uur.
    4. Centrifugeer 1 mL van het kweekmedium bij 4.000 x g gedurende 5 min. Breng 200 μL van de supernatant over in een schone buis van 1,5 ml. Bereid L-leucine-oplossingen (HPLC (High-Performance Liquid Chromatography)-kwaliteit) van 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 en 1 g · L-1 als standaard.
    5. Voeg 100 μL van 1 mM Triethylamine en 100 μL fenyl-isothiocyanaat van 1 M toe aan het supernatant en de normen, meng ze zachtjes en inbroed ze op kamertemperatuur gedurende 1 uur18.
      Let op: Triethylamine en fenyl-isothiocyanaat kunnen ernstige brandwonden en oogbeschadigingen veroorzaken en zijn schadelijk bij inademing. Draag handschoenen en een masker en voer deze stap zo mogelijk uit in een rook afzuigkap.
    6. Voeg 400 μL n-hexaan toe aan dezelfde buis en Vortex het voor 10 s. Filtreer de onderste fase met de aminozuur derivaten door een 0,2 μm polytetrafluorethyleen membraan.
      Let op: n-hexaan kan huidirritatie veroorzaken. Draag handschoenen en beschermende kleding. Als het in aanraking komt met de huid, spoel de huid dan met veel water.
    7. Bereid mobiele fase A door mengen van 0,1 M Natriumacetaat (pH 6,5) en acetonitril in een 99.3:0.7 volumetrische ratio. Bereid acetonitril (80% v/v) als mobiele fase B. filter alle mobiele fasen door middel van 0,2 μm polytetrafluorethyleen membranen.
      Let op: acetonitril is schadelijk bij inademing en kan irritaties van de huid en ogen veroorzaken. Draag handschoenen en beschermende kleding en voer deze stap uit in een rook afzuigkap.
    8. Voer 1 μL van het monster uit op een ultra-HPLC die is uitgerust met een C18-kolom volgens het elutie-programma in tabel 1 met een debiet van 0,42 ml · min-1 en een kolomtemperatuur van 40 °c. Detecteer de beoogde aminozuren bij 254 nm met een diode array detector en bereken hun concentraties door de piek gebieden in kaart te brengen op de standaard curve.
Tijd (min) Mobiele fase A (%) Mobiele fase B (%)
0 98 2
3,5 70 30
7 43 57
7,1 0 100
11 98 2

Tabel 1: elution-programma voor de kwantificering van aminozuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voor het selectiesysteem moet een scherpe afname in OD600 voor stammen die het zeldzame-codon-rijke gen met antibioticaresistentie verkotteren, worden geobserveerd in vergelijking met de stam die het wild-type antibioticumresistentie-gen verveelt wanneer gekweekt in een geschikte medium (Figuur 1a). Onder dezelfde omstandigheden wordt de afname in cel OD600 duidelijker naarmate het aantal zeldzame Codons in het gen met antibioticaresistentie toeneemt (Figuur 1a). Opgemerkt moet worden dat de remming van zeldzame codon op eiwit expressies meestal plaatsvindt onder uitgehongerd voorwaarden. Daarom, als het LB-medium niet goed verdund is, zal er geen significante afname in cel OD600 worden waargenomen voor de stam die het zeldzame-codon-rijke marker-gen verveelt in vergelijking met de stam die het wild-type-gen (Figuur 1b) verhard. Na extra voeding van het overeenkomstige aminozuur, zal de OD600 voor de stam die het zeldzame-codon-rijke antibioticaresistentie-gen verveelt aanzienlijk toenemen en die van de stam die het wild-type gen verveelt, benaderen (figuur 1c).

Figure 1
Figuur 1: effecten van zeldzame codon op de uitdrukkingen van marker genen die worden gebruikt voor de selectie en de screening systemen. a) de cel od600 voor een E. coli stammen die het antibioticaresistentie-gen (kanR) met 6, 16, 26 en 29 LEUCINE rare-codon (RC6, RC16, RC26 en RC29) verteren, na 5 uur incubatie. b) de cel od600 voor een E. coli stam die het wild type (WT) en de zeldzame-codon-Rich kanR (RC) in 1x, 0.5 x en 0.2 x lb media verveelt na 5 uur incubatie. c) effecten van het voeden van L-leucine op de celgroei voor E. coli stammen die het Leucine rare-codon-Rich kanR -gen harkotteren na 5 uur incubatie. De waarden en foutbalken vertegenwoordigen het gemiddelde en de SD (n = 6). De voeding van L-leucine verhoogde de OD600 aanzienlijk voor cellen die de zeldzame-codon-rijke kanRverveelt. De enige uitzondering was de voeding van 2 g · L-1 l-Leucine door een hoge SD in od600 voor de toevoer behandeling. d) effecten van zeldzame codon en L-leucine op GFP-expressies van het wild type (WT) en de Leucine rare-codon-Rich (RC)-genen na 16 uur incubatie. De voeding van 0,5 – 2 L-1 l-Leucine verhoogde de intensiteit van de fluorescentie significant voor cellen die de zeldzame-codon-rijke GFP verharsen. De waarden en foutbalken vertegenwoordigen het gemiddelde en de SD (n = 3). * *P < 0,01, * * *p < 0,001 zoals bepaald door de tweezijdige t-toets, en alleen de belangrijkste resultaten werden getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Voor het screenings systeem zullen de intensiteit van de fluorescentie en het aantal fluorescerende cellen significant lager zijn voor de stam die het fluorescerende eiwit uit het zeldzame codon-rijke gen uitdrukt dan uit het wild-type-gen (figuur 1d en Figuur 2). Bij het gebruik van het paarse eiwit moet de kleur die is ontwikkeld uit de zeldzame-codon-rijke PPG lichter zijn dan die van het wild-type gen, wanneer het wordt uitgedrukt onder dezelfde omstandigheden voor dezelfde incubatieperiode (Figuur 3). Het voederen van het overeenkomstige aminozuur zal eiwit uitdrukkingen uit de zeldzame-codon-rijke genen herstellen. Voor stammen die de zeldzame-codon-rijke GFPverharsen, moet de intensiteit van de fluorescentie (figuur 1d) en het aantal fluorescerende cellen (Figuur 2) significant toenemen en de stammen van het wild-type GFP benaderen . Wanneer onverdund LB wordt gebruikt, zouden de aminozuren in het medium voldoende zijn om langzame expressie van de zeldzame-codon-rijke PPG mogelijk te maken, zelfs zonder extra L-leucine voeding, en het uitgesproken paarse eiwit zou zichtbaar worden zodra de cellen worden gepelleteerd ( Figuur 3). Dit verbergt echter niet het feit dat genexpressie uit de zeldzame-codon-rijke PPG drastisch werd versterkt door het voeden van de L-leucine tot 2 g · L-1, vooral wanneer waargenomen in de vloeibare cultuur (Figuur 3). Daarom is de vloeibare cultuur een betere keuze voor screening op basis van chromogene eiwitten, en het gebruik van verdund LB-medium zou een significant verschil brengen tussen de fenotypes geïnduceerd door het wild-type en de zeldzame-codon-rijke genen.

Figure 2
Figuur 2: Het aantal fluorescerende E. coli cellen die de wild-type GFP of de Leucine zeldzame codon-Rich GFP (GFP-RC) haven na de toevoeging van L-leucine. Cellen werden gekweekt in 1x LB medium. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: kleurontwikkeling voor cellen die de wild-type (WT) en de Leucine rare-codon-Rich (RC) PPG genen die een paars eiwit coderen in 1x lb medium (linker paneel) en het effect van L-leucine voeden op celkweek kleurontwikkeling ( rechter paneel). De PPG -genen werden geïnduceerd toen de cellen de exponentiële fase binnenkwamen en de beelden 3 uur na de inductie werden opgenomen. De L-leucine werd samen met de inductor in de toevoer test aan het medium toegevoegd. De gekleurde cirkels werden gegenereerd door het plukken van de kleuren van de celculturen en de celpellets. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

De zeldzame-codon-gebaseerde strategie is in staat om overproducers van de beoogde aminozuren uit de mutatie bibliotheek te identificeren, en deze mutanten moeten hogere hoeveelheden van de beoogde aminozuren produceren dan de moeder stammen (Figuur 4).

Figure 4
Figuur 4: aminozuren geproduceerd door het wild-type en de gemuleerde stammen geïdentificeerd door de zeldzame-codon gebaseerde strategie. a) L-leucine producties van E. coli stammen geïdentificeerd uit mutatie bibliotheken door de kanR-RC29 (El-1 tot El-5) en de GFP-RC die havens 29 en 19 LEUCINE zeldzame Codons (El-6 tot El-10), respectievelijk. (b) L-arginine producties van Corynebacterium glutamicum stammen geselecteerd door de zeldzame-codon-Rich kanR, die bevatte acht arginine zeldzame Codons (AGG). Het marker gen werd geïntroduceerd in de C. glutamicum mutatie bibliotheken afgeleid van de wild-type stam ATCC13032. Het selectie medium was 0,3 x CGIII geleverd met 25 μg · mL-1 kanamycine. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het aantal zeldzame Codons in de marker genen en het selectie-of screening medium is van cruciaal belang voor de remming van eiwit expressies uit de zeldzame-codon-gemodificeerde marker genen. Als er geen significant verschil kan worden gedetecteerd tussen eiwit uitdrukkingen van de wild-type marker genen en hun derivaten, kan het verhogen van het aantal zeldzame Codons of het gebruik van een nutriënt-beperkt medium de verschillen versterken. Echter, als het effect van de remming te sterk is, kunnen de eiwit uitdrukkingen niet worden teruggewonnen, zelfs niet door extra voeding van de overeenkomstige aminozuren. In dit geval moet het aantal zeldzame Codons in de marker genen worden verlaagd om een deel van de stress te verlichten. Een andere manier om het verfijnen van de selectie of de screening striktheid is het aanpassen van de kopie-nummers en de expressieniveaus van de zeldzame-codon-Rich marker genen. Het verminderen van het Kopieer nummer en de uitdrukkings niveaus van de marker genen leidt meestal tot sterkere differentiaties tussen het aminozuur overproducers en de initiële stammen. Daarom moeten vectoren met het lage kopie nummer replicatie oorsprong zoals p15A of pSC101, evenals zwakke promotors, worden gebruikt. Als het marker-gen wordt aangedreven door een inductieve promotor, wordt lage inductie aanbevolen.

De zeldzame-codon gebaseerde strategie voor de selectie of screening voor aminozuur overproducers is een omgekeerde aanpassing van de veelgebruikte strategie van "codon Optimization", die tot doel heeft de uitingen van exogene eiwitten te vergemakkelijken. In codon-optimalisatie worden de zeldzame Codons op de doel genen vervangen door de synoniem gemeenschappelijke met betrekking tot de gastheer; Zo kunnen de genen van andere organismen veel sneller worden vertaald in eiwitten dan die exogene genen met hoge proporties van zeldzame Codons19. Daarom is het redelijk om te veronderstellen dat de "omgekeerde optimalisatie", die de gemeenschappelijke Codons aan hun synoniem zeldzame, moet remmen genexpressies. Echter, de genen expressies moeten worden hersteld door verbeterde opladen van de corresponderende zeldzame Trna's wanneer de beoogde aminozuren intracellulair accumuleren. De opname van zeldzame Codons verhoogt de drempel van de aminozuur concentratie in eiwit expressies, die een potentiële strategie biedt om te selecteren of te schermen voor aminozuur overproducers in combinatie met de juiste marker genen.

Naast de antibioticaresistentiegenen, de fluorescerende proteïne genen en de chromogene eiwit genen die in het protocol worden gebruikt, kunnen verschillende marker genen worden ingezet om het zeldzame-codon-gebaseerde selectie-of screeningsysteem vast te stellen. Zo kunnen dodelijke genen zoals Tolc20 en sacb21 worden gebruikt om aminozuur overproducers te selecteren. In dit geval moeten gemeenschappelijke Codons op de genen die behoren tot het antidotum systeem worden vervangen door de synoniem zeldzame Codons van de beoogde aminozuren. Stammen die de doelgerichte aminozuren overproduceren, kunnen het tegengif systeem lanceren en dus de toxische effecten overleven die door de dodelijke genen worden geïnduceerd.

Opgemerkt moet worden dat bijwerkingen kunnen optreden bij het gebruik van hoge hoeveelheden aminozuren in de toevoer test. Dit komt omdat sommige aminozuren giftig voor de micro-organismen zijn. Bijvoorbeeld, een concentratie van rond 100 mg · L-1 voor l-serine is in staat om de groei van E. coli22remmen. Echter, hoewel lager dan die van het wild-type gen, vonden we dat voeding tot 2 g · L-1 l-serine kan nog steeds de uitdrukkingen van antibioticaresistentiegenen herstellen die rijk zijn aan serine zeldzame codon13. Daarom zou de toxiciteit van het aminozuur, althans voor L-Serine, de betrouwbaarheid van de toevoer test niet in gevaar brengen. Om de potentiële negatieve effecten van aminozuur toxiciteit op de productiviteiten van de beoogde stammen te overwinnen, kunnen strategieën zoals willekeurige mutagenese en de verhoging van aminozuur exportaties23 worden toegepast. In feite is de zeldzame-codon-gebaseerde methode geschikt voor het identificeren van tolerante stammen die aminozuren kunnen weerstaan of overproduceren boven de toxische niveaus. De belangrijkste mutaties die aminozuur tolerantie verlenen kunnen worden geïdentificeerd en geïntroduceerd in de beoogde stammen, die de ideale gastheren voor de constructies van aminozuur overproducers zou zijn.

Het zeldzame-codon-gebaseerde selectie-of screeningsysteem zorgt voor een hoge getrouwheid. Met andere woorden, stammen geïdentificeerd door het systeem worden verondersteld te zijn de overproducenten van de beoogde aminozuren. In sommige gevallen kunnen de kandidaten die de antibiotica selectie overleven echter geen hogere hoeveelheden van de beoogde aminozuren produceren dan de ouderstam. Dit kan worden toegeschreven aan de antibioticaresistentie verkregen door de stammen door middel van mutagenese en vervolgens een verlies van de selectie plasmide24. Als gevolg daarvan, stammen zonder verbeterde aminozuur productiviteiten kunnen overleven de antibiotica stress en ontsnappen aan de selectie. Deze valse positieve stammen kunnen worden geëlimineerd door een andere selectie marker in de selectie plasmide te plaatsen, zoals een wild-type gen dat resistentie toekent aan een ander antibioticum. Stammen die de selectie van plasmide verloren zijn minder kans op dubbele weerstand tegen de twee antibiotica te krijgen en zal worden geëlimineerd tijdens de selectie.

Mutanten geïdentificeerd door het zeldzame-codon-gebaseerde systeem moeten in staat zijn om de beoogde aminozuren te overproduceren in vergelijking met de initiële stammen. De aminozuur productiviteiten voor de geselecteerde stammen kunnen echter nog steeds lager zijn dan de industriële eisen. Dit wijst niet op een mislukking van de zeldzame-codon-gebaseerde strategie, aangezien de stam prestaties onafhankelijk zijn van het selectie-of screeningproces, maar afhankelijk zijn van factoren zoals de kenmerken van de initiële stam, de benadering van mutagenese, de grootte van de Mutatie bibliotheek en de fermentatie condities. Om hoge productie stammen te verkrijgen, moet aandacht worden besteed aan de strategieën van strain engineering, zoals door willekeurige mutagenese of door rationeel ontwerp van de aminozuur biosynthetische trajecten. Het combineren van adaptieve laboratorium evolutie en de zeldzame-codon-gebaseerde strategie zou het verkrijgen van aminozuur overproducers vergemakkelijken.

De methionine en het tryptofaan hebben geen alternatieve Codons onder de 20 Proteïnogeen aminozuren. Daarom kan deze strategie niet direct worden toegepast op deze aminozuren. Een mogelijke oplossing is het gebruik van engineered Trna's die in staat zijn om de stop Codons te herkennen om deze aminozuren te dragen. Zo kunnen de corresponderende stopcodons worden aangenomen als de kunstmatige zeldzame Codons van deze aminozuren25,26.

Een van de grootste tekortkomingen met betrekking tot de conventionele, op analoge basis gebaseerde strategie voor de selectie van aminozuur overproducers is het hoge vals-positieve percentage5,27. Stammen die door mutagenese gaan, kunnen gemakkelijk resistentie verkrijgen tegen het toxische aminozuur analoga, en de tolerantie kan zelfs worden verworven zonder de hulp van mutagene agentia27. Deze stammen kunnen gemakkelijk ontsnappen aan de selectiedruk van het aminozuur analogen en, bijgevolg, de geselecteerde stammen zijn meestal niet de ware aminozuur overproducers die sterk opoffert de efficiëntie van het selectieproces.

In tegenstelling, de zeldzame-codon gebaseerde strategie overtreft de traditionele analoge gebaseerde methode door het inschakelen van nauwkeurige en snelle identificaties van aminozuur overproducers. Voor onze kennis is dit de eerste strategie die de natuurlijke wet van codon bias aanneemt. Het is alleen afhankelijk van een enkel zeldzaam-codon-rijk marker gen en elimineert dus het gebruik van toxische analogen. De marker genen zijn over het algemeen niet giftig voor de gastheer stammen, en de eiwit uitdrukkingen van zeldzame-codon-rijke genen zijn voornamelijk afhankelijk van de intracellulaire concentraties van de overeenkomstige aminozuren vanwege de universele en strikte wet van codon bias over alle soorten. Dit zou voorkomen dat de stammen ontsnappen aan de selectiedruk. Behalve, vanwege de grote diversiteit van marker genen, de zeldzame-codon gebaseerde strategie zou kunnen bieden verschillende keuzes voor zowel de selectie en de screening van aminozuur overproducers.

Als gevolg van het universele fenomeen van codon bias in alle levende organismen28, de zeldzame-codon gebaseerde selectie of screening strategie kan theoretisch worden gebruikt om andere micro-organismen naast E. coli, vooral die met industriële Potentieel. Bij het overstappen op een andere host, moet de keuze van zeldzame Codons die worden gebruikt voor het ontwerpen van de marker genen gebaseerd zijn op de codon gebruiks frequenties en de Abundances van de corresponderende Trna's voor de specifieke gastheer. Het medium dat voor selectie of screening wordt gebruikt, moet ook dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd. Een voorbeeld is de meest gebruikte C. glutamicum in aminozuur fermentaties. Een zeldzame-codon-gemodificeerde kanR gen met acht arginine zeldzame Codons (AGG) is aangetoond effectief bij het selecteren van C. glutamicum L-arginine overproducers door een eerdere studie13 (figuur 4b). Verkenningen van de zeldzame-codon-gebaseerde strategie moeten de constructies en het begrip van aminozuur overproducers te vergemakkelijken. Naast aminozuren kan de zeldzame-codon-gebaseerde strategie ook worden gebruikt met isobutanol, 3-methyl-1-butanol, 2-methyl-1-butanol en andere producten die dezelfde biosynthetische trajecten met bepaalde aminozuren29delen. Stammen geïdentificeerd door marker genen die de haven van de zeldzame Codons van deze aminozuren zijn in staat om te overproduceren van de precursor verbindingen, die kunnen worden gekanaliseerd naar de synthese van het aminozuur derivaten. Daarom, de zeldzame-codon gebaseerde strategie kan dienen als een indirecte maar snelle methode om de potentialen van de stammen in het accumuleren van deze chemicaliën ofwel intra-of extracellulair weer te geven. Belangrijke mutaties die verhoogde aminozuur productiviteiten van verschillende overproducenten verlenen, kunnen worden geïdentificeerd door diepe sequentiëren en afzonderlijk of gelijktijdig in industriële stammen worden geïntroduceerd om de productie van aminozuren verder te verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het werk werd gezamenlijk gesteund door de National Natural Science Foundation van China (Grant No. 21676026), het National key R & D-programma van China (Grant No. 2017YFD0201400), en de China postdoctorale Science Foundation (Grant No. 2017M620643). De werken in het UCLA Institute of vooruitgang (Suzhou) werden gesteund door de interne subsidies van de provincie Jiangsu en het Suzhou Industrial Park.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Thermo 51101
EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit Transgen EM111-01
EasyPure Quick Gel Extraction Kit Transgen EG101-01
Gibson assembly master mix NEB E2611S
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Solarbio I8070
L-leucine Sigma L8000
Microplate reader Biotek Synergy 2
n-hexane Thermo H3061
Phenyl isothiocyanate Sigma P1034
PrancerPurple CPB-37-441 ATUM CPB-37-441
TransStar FastPfu Fly DNA polymerase Transgen AP231-01
Triethylamine Sigma T0886
Ultra-high performance liquid chromatography Agilent 1290 Infinity II
Wild type C. glutamicum ATCC 13032
XL10-Gold E. coli competent cell Agilent 200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column Agilent 959759-902K

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tatsumi, N., Inui, M. Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , Springer-Verlag. Berlin and Heidelberg. (2012).
  2. Tonouchi, N., Ito, H. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. Yokota, A., Ikeda, M. , Springer. 3-14 (2017).
  3. Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , US6403342B1 (2005).
  4. Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
  5. Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
  6. Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
  7. Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
  8. Crick, F. H. C. On the genetic code. Science. 139 (3554), 461-464 (1963).
  9. Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
  10. Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
  11. Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
  12. Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
  13. Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).
  14. Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
  15. Xiong, A. -S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
  16. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  18. Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
  19. Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
  20. Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
  21. Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
  22. Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
  23. Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
  24. Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
  25. Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
  26. Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507 (2014).
  27. Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
  28. Hershberg, R., Petrov, D. A. Selection on codon bias. Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).
  29. Huo, Y. -X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).

Tags

Biochemie uitgave 148 aminozuur overproducer zeldzame codon tRNA vertaling screening selectie TL-eiwit chromogene proteïne antibioticaresistentie-gen
Identificeren van aminozuur Overproducers met behulp van zeldzame-codon-Rich markers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huo, Y. X., Zheng, B., Wang, N.,… More

Huo, Y. X., Zheng, B., Wang, N., Yang, Y., Liang, X., Ma, X. Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers. J. Vis. Exp. (148), e59331, doi:10.3791/59331 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter