قدرة التمايز للخلايا الدهنية ارتشاح الابهري البشرية السلف
Summary
والهدف من هذا البروتوكول اختبار قدرة الخلايا السلف المستمدة من الأنسجة الدهنية ارتشاح البشرية على التفريق في الأنساب خلية متعددة. تمت مقارنة التمايز للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام البشرية، التي من المعروف أن تفرق في adipocyte، أوستيوسيتي، والأنساب تشوندروسيتي.
Abstract
الأنسجة الدهنية مصدر غنى قوية متعددة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) قادر على التفريق في أوستيوجينيك، أديبوجينيك، والأنساب تشوندروجينيك. أديبوجينيك التفريق بين الخلايا السلف إليه رئيسية يقود التوسع في الأنسجة الدهنية، والخلل الوظيفي في الاستجابة إلى السمنة. وهكذا فهم التغيرات في الأنسجة الدهنية ارتشاح (بفات) ذات الصلة سريرياً في الأمراض الأيضية. ومع ذلك، كانت الدراسات السابقة يغلب أداؤها في الماوس والحيوانات الأخرى نماذج. هذا البروتوكول يستخدم البشرية الصدر بفات العينات التي جمعت من المرضى الذين يخضعون لجراحة الشريان التاجي بالاختلاس. الأنسجة الدهنية من الشريان الاورطي تصاعدي تم جمعها واستخدامها اكسبلانتيشن كسر الأوعية الدموية stromal. نحن سبق وأكدت وجود الخلايا الدهنية السلف في بفات البشرية مع القدرة على التفريق في المحتوية على الدهن adipocytes. في هذه الدراسة، ونحن حلل كذلك إمكانات تمايز الخلايا من الكسر الأوعية الدموية stromal، يفترض أنها تحتوي على خلايا السلف قوية متعددة. أننا بالمقارنة مع الخلايا المستمدة من بفات بنخاع العظام البشرية ماجستير للتمايز في أديبوجينيك، أوستيوجينيك، والأنساب تشوندروجينيك. وبعد 14 يوما تمايز، استخدمت البقع محددة للكشف عن تراكم الدهن في adipocytes (س زيت أحمر)، رواسب كالسيفيك في خلايا أوستيوجينيك (الأليزارين الأحمر)، أو الجليكوزامينوجليكان والكولاجين في الخلايا تشوندروجينيك (Masson’s Trichrome). بينما نخاع العظام MSC كفاءة متباينة في جميع الأنساب الثلاثة، قد الخلايا المستمدة من بفات أديبوجينيك وتشوندروجينيك المحتملة، ولكنها تفتقر إلى إمكانات osteogenic قوية.
Introduction
الأنسجة الدهنية مصدر غنى قوية متعددة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) قادر على التفريق في أوستيوجينيك، أديبوجينيك، وتشوندروجينيك الأنساب1. يوسع هذا النسيج من خلال تضخم adipocytes ناضجة وتمايز نوفو دي ماجستير المقيمين في adipocytes. الأنسجة الدهنية ارتشاح (بفات) يحيط بالأوعية الدموية وينظم وظيفة الأوعية الدموية2،3. توسيع بفات الناجمة عن السمنة يؤدي إلى تفاقم أمراض القلب والأوعية الدموية. بينما كانت إمكانات لجنة السلامة البحرية مولتيبوتينت من المستودعات الدهنية تحت الجلد البشري جيدا درس4،5، أي دراسات اكسبلانتيد وتقييم قدرة الخلايا البشرية السلف المستمدة من بفات، يحتمل نظراً للتمايز اختزاع للمشتريات. وهكذا، والهدف من هذا العمل تقديم منهجية explant ونشر الخلايا السلف من البشرية بفات الابهري من المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية واختبار الميل إلى التفريق إلى أوستيوجينيك، تشوندروجينيك، والأنساب أديبوجينيك. لدينا مصدر بفات من الموقع لملامسة للاختلاس الالتفافية في ترتيب تصاعدي الشريان الاورطي للمرضى الذين يعانون من السمنة المفرطة يخضعون للاختلاس الشريان التاجي سيخضع لعملية جراحية. بفات طازجة-المعزولة انزيماتيكالي نات والكسر والأوعية الدموية stromal معزولة ويتم نشرها في المختبر، مما مكننا من اختبار قدرة التمايز للخلايا البشرية السلف المستمدة من بفات للمرة الأولى.
استخدام الأولية مثقف البشرية بفات stromal الأوعية الدموية الكسر، اختبرنا ثلاث فحوصات مصممة لحمل الخلايا الجذعية/السلف للتمييز تجاه أديبوجينيك، أوستيوجينيك، أو تشوندروجينيك الأنساب. دراستنا السابقة حددت عدد سكان من CD73 + CD105 + و + PDGFRa (CD140a) الخلايا التي يمكن التفريق بين قوة في adipocytes6، على الرغم من أن لا تم اختبارها على مولتيبوتينسي. وينظم بفات مباشرة7لهجة والتهاب الأوعية الدموية. والأساس المنطقي لاختبار إمكانيات التمايز هذه الخلية رواية السكان هو البدء في فهم تأثير المتخصصة بفات في وظيفة الأوعية الدموية، والآليات لتوسيع بفات خلال السمنة. هذه المنهجية ويعزز فهمنا لوظائف خلايا الأنسجة الدهنية المشتقة السلف، وتمكننا من تحديد ومقارنة أوجه الشبه والاختلاف للخلايا السلف من مصادر مختلفة من الأنسجة. ونحن بناء على النهج المتبعة وتم التحقق من صحتها لعزل والتفريق بين لجنة السلامة البحرية نحو الأنساب المختلفة وتحسين الإجراءات إلى أقصى حد ممكن بقاء الخلايا البشرية السلف المستمدة من بفات. هذه التقنيات لها تطبيقات واسعة في ميادين الجذعية والسلف تنمية البحوث والأنسجة الدهنية للخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخلايا الدهنية السلف من مستودعات مختلفة اختلافاً كبيرا في النمط الظاهري والتمايز المحتمل9. استزراع المتكفل بفات المستمدة من مانح واحد مريض في تحريض متزامنة أسفل ثلاثة مختلفة الأنساب، أديبوجينيك، أوستيوجينيك، وتشوندروجينيك، يسمح بإجراء تحقيق القدرة pluripotent هذه الرواية الت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف بالمساعدة من “التنقل للبحث” في المركز الطبي في ولاية ماين للمساعدة في شراء الأنسجة السريرية، والأنسجة وكور هيستومورفوميتري (بدعم من 1P20GM121301، L. لياو PI) في “ولاية ماين الطبي مركز البحوث” معهد تمزيقها وتلطيخ. هذا العمل كان يدعمها في المعاهد الوطنية للصحة منح R01 HL141149 (L. لياو).
Materials
| animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| cell strainer (70mm) | Corning | 352350 | |
| dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| permount | Fisher | SP15-500 | |
| phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
References
- Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
- Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. Differentiation of adipose stem cells. Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
- Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
- de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
- Majesky, M. W. Adventitia and perivascular cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).
- Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
- Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
- Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
