המטרה של פרוטוקול זה היא לבחון את היכולת של ובתאים נגזר רקמת שומן perivascular האדם להתמיין שושלות תאים מרובים. בידול היה לעומת גזע mesenchymal הנגזרות מח אנושי, אשר ידועה להבדיל לתוך adipocyte, osteocyte ו- chondrocyte שושלות.
רקמת שומן הוא מקור עשיר ורב עוצמה בתאי גזע mesenchymal (MSC) מסוגל להבדיל לתוך osteogenic, adipogenic, ו chondrogenic שושלות. Adipogenic הבידול של ובתאים הוא מנגנון מרכזי הנהיגה הרחבה רקמת שומן ועל תפקוד בתגובה השמנת יתר. הבנת שינויים רקמת שומן perivascular (PVAT) היא לפיכך הרלוונטית קלינית במחלה מטבולית. עם זאת, מחקרים קודמים היו יוכפל לאחר המרתו הופיעה העכבר, חיה אחרת מודלים. פרוטוקול זה משתמש אנושי דגימות PVAT בית החזה שנאספו בחולים שעברו ניתוח השתלת מעקף של עורקים. רקמת שומן מן העורקים נאסף ומשומשים עבור explantation של השבר בכלי הדם סטרומה. לנו קודם לכן אישר את הנוכחות של אדיפוז ובתאים ב PVAT האדם את היכולת להתמיין המכילים שומנים בדם adipocytes. במחקר זה, בהמשך ניתחנו את פוטנציאל התמיינות של תאים מן השבר בכלי הדם סטרומה, ככל הנראה המכיל ובתאים רב עוצמה. השווינו נגזר PVAT לתאי מח עצם האדם MSC עבור בידול לתוך adipogenic, osteogenic, chondrogenic שושלות. לאחר 14 ימים של בידול, כתמים מסוימים נוצלו לאתר הצטברות שומנים בדם adipocytes (שמן אדום O), פיקדונות calcific תאים osteogenic (Alizarin אדום), או glycosaminoglycans, קולגן בתאים chondrogenic (Trichrome של מאסון). בזמן מח העצם MSC ביעילות הבדיל לתוך כל שלוש שושלות, תאים PVAT, נגזר היה adipogenic ו- chondrogenic פוטנציאל, אבל חסרה פוטנציאל osteogenic חזקים.
רקמת שומן הוא מקור עשיר ורב עוצמה בתאי גזע mesenchymal (MSC) מסוגל להבדיל לתוך osteogenic, adipogenic, chondrogenic שושלות1. רקמה זו מרחיבה דרך היפרטרופיה של בוגרת adipocytes de novo הבידול של תושב MSC כדי adipocytes. רקמת שומן Perivascular (PVAT) המקיף את כלי הדם, מווסת את תפקוד כלי הדם2,3. השמנת יתר-induced PVAT הרחבה מחריף פתולוגיות לב וכלי דם. ואילו הפוטנציאל multipotent של MSC מן האדם מחסני אדיפוז תת עורית כבר למד היטב4,5, מחקר explanted, הערכת הקיבולת בידול של האדם נגזר PVAT ובתאים, סביר בשל invasiveness הרכש. לפיכך, מטרת עבודה זו היא לספק מתודולוגיה אל explant, להפיץ ובתאים של האדם PVAT של אבי העורקים של חולים עם מחלת לב וכלי דם, כדי לבדוק את הנטייה להבחין ל osteogenic, chondrogenic ו adipogenic שושלות שלהם. מקור שלנו PVAT הוא אתר של השקה של המעקף על עולה אבי העורקים של חולים שמנים שעברו ניתוח השתלת מעקף של עורקים. PVAT בודדים טרי enzymatically-חלופה מועדפת, השבר בכלי הדם סטרומה בודד ולאחר מופצות במבחנה, ומאפשרת לנו לבחון בפעם הראשונה את יכולת התמיינות של האדם נגזר PVAT ובתאים.
השימוש העיקרי תרבותי אנושי PVAT סטרומה וסקולרית שבר, בדקנו שלושה מבחני מתוכנן לגרום גזע/ובתאים להבדיל לכיוון adipogenic, osteogenic, או chondrogenic שושלות. המחקר שלנו מוקדמת לזהות אוכלוסייה של CD73 + CD105 +, תאים PDGFRa + (CD140a) יכולים להתמיין robustly adipocytes6, למרות multipotency שלהם לא נבדקה. PVAT ישירות מסדיר את הטון ודלקת כלי הדם7. הרציונל לבדיקת הפוטנציאל בידול של אוכלוסייה זו תא הרומן היא להתחיל להבין את השפעת PVAT על תפקוד כלי דם מיוחדות, ומנגנונים של התרחבות PVAT במהלך השמנת יתר. מתודולוגיה זו משפרת את ההבנה שלנו של הפונקציות של רקמת שומן נגזרת ובתאים, מאפשרת לנו לזהות ולהשוות והשונה של ובתאים ממקורות רקמות שונות. עלינו לבנות על גישות הוקמה המאומת בידוד, המבדילים MSC לכיוון שושלות שונות, לייעל את ההליכים כדי למקסם את הכדאיות של האדם נגזר PVAT ובתאים. טכניקות אלה יש שימושים רחב בתחומים של גזע קדמון תא רקמת שומן ומחקר ופיתוח.
אדיפוז ובתאים של מחסני שונים להשתנות באופן נרחב פוטנציאליים, פנוטיפ ובידול9. Culturing נגזר PVAT אבות מתורם יחיד החולה באינדוקציה סימולטני למטה שלוש שושלות שונות, adipogenic, osteogenic, ו chondrogenic, מאפשר חקירה ומבוקרות היטב pluripotent לקיבולת של הרומן הזה אוכלוסיית ובתאים. המתודולוגיה שתוארו בדו ח…
The authors have nothing to disclose.
אנו להכיר את הסיוע של ניווט המחקר במרכז הרפואי מיין עבור סיוע הרכש של רקמות קליני, ואת Histopathology ליבה Histomorphometry (נתמך על-ידי 1P20GM121301, ל Liaw PI)-המחקר במרכז הרפואי מיין מכון חלוקתה, מכתים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH להעניק R01 HL141149 (ל’ Liaw).
animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4C |
Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
cell strainer (70mm) | Corning | 352350 | |
dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate |
DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
formalin | NewComerSupply | 1090 | |
gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
HBSS | Lonza | 10-547F | |
IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
permount | Fisher | SP15-500 | |
phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |